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公司新闻/正文
【J Hematol Onco】23分+，hUC-EVs-ATO降低急性GVHD严重程度的研究
764 人阅读发布时间：2022-09-27 16:22
同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)用于诊治各种造血系统恶性**，但急性移植物抗宿主病(aGVHD)是移植后的并发症，虽皮质类固醇和替代疗法已在临床上用于诊治aGVHD，但效果不佳。研究表明se2o3(ATO)可改善aGVHD，但其生物利用度低，具全身毒性，无法到达靶部位，而MSC-EV具有与MSC相当的诊治效果，且无致瘤性和栓塞问题，因此北京大学张晓军和黄晓辉课题组将ATO装载到hUC-EVs中，以研究hUC-EVs-ATO在HSCT后aGVHD小鼠模型中的诊治效果和潜在机制，并将成果发表在J Hematol Oncol (IF:23.169)杂志上。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9306027/
技术路线：
实验结果：
1. hUC-EVs-ATO的表征
对hUC-MSC细胞进行鉴定（诱导分化成骨、成脂和软骨形成，FACS检测表面标志物）后，与ATO共孵育，UBV处理1hr，收集培养上清液，分离EV，质谱法测定EV中ATO的浓度。下图是hUC-EVs和hUC-EVs-ATO表征结果，两者在大小、形态和标志蛋白方面没有差异。
2. hUC-EVs-ATO减轻了小鼠模型中的aGVHD
诱导BALB/c小鼠为aGVHD模型后，第7天开始连续5次腹腔注射PBS、ATO(1mg/kg)、hUC-EVs(1x106/mouse)和hUC-EVs-ATO(1x106/mouse，含4nmol ATO)，第14天取组织进行IHC分析，发现ATO和hUC-EVs诊治效果相似，但hUC-EVs-ATO效果**，表现在临床评分**、病理病变极小和存活率的增加。表明hUC-EVs-ATO给药减轻了同种异体HSCT中aGVHD的严重程度。
3. hUC-EVs-ATO在aGVHD小鼠中调节T细胞群，但在体外没有
为了探究hUC-EVs-ATO的作用机制，取第14天的肝脾组织，FACS分析CD4+T细胞群时发现hUC-EVs-ATO诊治组的小鼠肝脾中CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例增加，IFN-γ+CD4+T和IL-17+CD4+ T 细胞比例降低。极化条件下，hUC-EVs-ATO处理C57BL/6小鼠脾中分离的初始CD4+T细胞后，既未减少Th1和Th17细胞，也未增加Treg细胞。表明hUC-EVs-ATO在aGVHD体内对同种异体T细胞的影响较大，但在体外对T细胞无影响。
4. hUC-EVs-ATO的诊治效果依赖于巨噬细胞
上述结果表明hUC-EVs-ATO可能调节T细胞分化，而T细胞分化需要巨噬细胞，在给予hUC-EVs-ATO诊治小鼠前，先用Cl2MDP耗尽巨噬细胞，发现hUC-EVs-ATO不能减轻aGVHD的严重程度，临床评分、组织病理评分和生存率与对照组无差异。表明巨噬细胞的缺失明显抑制了hUC-EVs-ATO的诊治效果。
5. hUC-EVs-ATO上调aGVHD小鼠中的M2巨噬细胞
接着探究hUC-EVs-ATO是否影响aGVHD小鼠中巨噬细胞的极化，收集第14天小鼠腹腔巨噬细胞，FACS分析显示hUC-EVs明显降低M1(CD11b+F4/80+CD86+)巨噬细胞量，而hUC-EVs-ATO进一步降低该细胞。相反M2 (CD11b+F4/80+CD206+)巨噬细胞量在hUC-EVs-ATO处理后大幅度增加，这一结果与IF对肝肠中巨噬细胞表型的分析结果一致。同时，通过评估小鼠血清中M1和M2相关因子表达水平变化时，发现TNF-α, IL-6和 IL-1β水平明显降低，IL-10 和TGF-β水平升高。表明hUC-EVs-ATO促进了aGVHD小鼠的M2极化。
6. hUC-EVs-ATO在体外更有效地将M1巨噬细胞极化为M2巨噬细胞
为进一步验证hUC-EVs-ATO是否可以促进巨噬细胞从M1型向M2型极化，用hUC-EVs, ATO或 hUC-EVs-ATO在体外处理BMDM-M1巨噬细胞，结果显示hUC-EVs-ATO组的CD86+M1巨噬细胞数量降低，CD206+M2巨噬细胞增多。QPCR结果表明hUC-EVs-ATO组明显降低M1相关基因表达，上调M2相关基因表达。同时hUC-EVs-ATO可被RAW264.7细胞摄取，并诱导其由M1向M2极化。说明hUC-EVs-ATO可通过将M1细胞极化成M2细胞。
7. hUC-EVs-ATO通过以mTOR方式诱导自噬促进M2巨噬细胞极化
研究表明自噬参与巨噬细胞极化，因此作者将关注点转移到hUC-EVs-ATO对巨噬细胞自噬的影响。TEM和WB显示用hUC-EVs, ATO或 hUC-EVs-ATO在体外处理BMDM-M1巨噬细胞，均能增加自噬体的量、促进LC3II积累和p62的降解，且hUC-EVs-ATO作用效果极明显。p-mTOR的水平在hUC-EVs-ATO处理下明显降低，利用mTOR**剂MHY1485预处理BMDM-M1后，hUC-EVs-ATO介导的LC3II表达增加和p-mTOR、p62的降低被明显抑制，抑制了hUC-EVs-ATO对M1细胞向M2细胞极化；而mTOR抑制剂雷帕霉素刺激BMDM-M1后，hUC-EVs-ATO对M2巨噬细胞极化的促进作用得到加强。表明hUC-EVs-ATO通过以mTOR方式诱导自噬促进M2巨噬细胞极化。
8. BMT后hUC-EVs-ATO保留了GVL效应
保持移植物抗淋巴瘤（GVL）效应是预防血液恶性**复发的关键，为探究hUC-EVs-ATO对GVL效应的影响，将A20-Luc细胞与T细胞耗尽的BM细胞或T细胞耗尽的BM细胞和脾细胞结合移植到BALB/c受体中，接受T细胞的小鼠体内**信号均降低，但没有hUC-EVs-ATO的存在小鼠极终死于aGVHD；接受hUC-EVs-ATO和T细胞的小鼠，存活率明显提高，表明hUC-EVs-ATO减轻了aGVHD，且不损害GVL活性。
讨论：
本研究中作者发现hUC-EVs-ATO可在不影响GVL活性的情况下降低allo-HSCT后的aGVHD。hUC-EVs-ATO通过提高体内外mTOR介导的自噬水平来促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞极化。但hUC-EVs-ATO对mTOR上游通路和自噬代谢通路的影响，及保留GVL效应的具体机制需进一步探究。该研究成果提供了一种降低aGVHD严重程度的新方法，同时保留有益的GVL效应。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9306027/
技术路线：
实验结果：
1. hUC-EVs-ATO的表征
对hUC-MSC细胞进行鉴定（诱导分化成骨、成脂和软骨形成，FACS检测表面标志物）后，与ATO共孵育，UBV处理1hr，收集培养上清液，分离EV，质谱法测定EV中ATO的浓度。下图是hUC-EVs和hUC-EVs-ATO表征结果，两者在大小、形态和标志蛋白方面没有差异。
2. hUC-EVs-ATO减轻了小鼠模型中的aGVHD
诱导BALB/c小鼠为aGVHD模型后，第7天开始连续5次腹腔注射PBS、ATO(1mg/kg)、hUC-EVs(1x106/mouse)和hUC-EVs-ATO(1x106/mouse，含4nmol ATO)，第14天取组织进行IHC分析，发现ATO和hUC-EVs诊治效果相似，但hUC-EVs-ATO效果**，表现在临床评分**、病理病变极小和存活率的增加。表明hUC-EVs-ATO给药减轻了同种异体HSCT中aGVHD的严重程度。
3. hUC-EVs-ATO在aGVHD小鼠中调节T细胞群，但在体外没有
为了探究hUC-EVs-ATO的作用机制，取第14天的肝脾组织，FACS分析CD4+T细胞群时发现hUC-EVs-ATO诊治组的小鼠肝脾中CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例增加，IFN-γ+CD4+T和IL-17+CD4+ T 细胞比例降低。极化条件下，hUC-EVs-ATO处理C57BL/6小鼠脾中分离的初始CD4+T细胞后，既未减少Th1和Th17细胞，也未增加Treg细胞。表明hUC-EVs-ATO在aGVHD体内对同种异体T细胞的影响较大，但在体外对T细胞无影响。
4. hUC-EVs-ATO的诊治效果依赖于巨噬细胞
上述结果表明hUC-EVs-ATO可能调节T细胞分化，而T细胞分化需要巨噬细胞，在给予hUC-EVs-ATO诊治小鼠前，先用Cl2MDP耗尽巨噬细胞，发现hUC-EVs-ATO不能减轻aGVHD的严重程度，临床评分、组织病理评分和生存率与对照组无差异。表明巨噬细胞的缺失明显抑制了hUC-EVs-ATO的诊治效果。
5. hUC-EVs-ATO上调aGVHD小鼠中的M2巨噬细胞
接着探究hUC-EVs-ATO是否影响aGVHD小鼠中巨噬细胞的极化，收集第14天小鼠腹腔巨噬细胞，FACS分析显示hUC-EVs明显降低M1(CD11b+F4/80+CD86+)巨噬细胞量，而hUC-EVs-ATO进一步降低该细胞。相反M2 (CD11b+F4/80+CD206+)巨噬细胞量在hUC-EVs-ATO处理后大幅度增加，这一结果与IF对肝肠中巨噬细胞表型的分析结果一致。同时，通过评估小鼠血清中M1和M2相关因子表达水平变化时，发现TNF-α, IL-6和 IL-1β水平明显降低，IL-10 和TGF-β水平升高。表明hUC-EVs-ATO促进了aGVHD小鼠的M2极化。
6. hUC-EVs-ATO在体外更有效地将M1巨噬细胞极化为M2巨噬细胞
为进一步验证hUC-EVs-ATO是否可以促进巨噬细胞从M1型向M2型极化，用hUC-EVs, ATO或 hUC-EVs-ATO在体外处理BMDM-M1巨噬细胞，结果显示hUC-EVs-ATO组的CD86+M1巨噬细胞数量降低，CD206+M2巨噬细胞增多。QPCR结果表明hUC-EVs-ATO组明显降低M1相关基因表达，上调M2相关基因表达。同时hUC-EVs-ATO可被RAW264.7细胞摄取，并诱导其由M1向M2极化。说明hUC-EVs-ATO可通过将M1细胞极化成M2细胞。
7. hUC-EVs-ATO通过以mTOR方式诱导自噬促进M2巨噬细胞极化
研究表明自噬参与巨噬细胞极化，因此作者将关注点转移到hUC-EVs-ATO对巨噬细胞自噬的影响。TEM和WB显示用hUC-EVs, ATO或 hUC-EVs-ATO在体外处理BMDM-M1巨噬细胞，均能增加自噬体的量、促进LC3II积累和p62的降解，且hUC-EVs-ATO作用效果极明显。p-mTOR的水平在hUC-EVs-ATO处理下明显降低，利用mTOR**剂MHY1485预处理BMDM-M1后，hUC-EVs-ATO介导的LC3II表达增加和p-mTOR、p62的降低被明显抑制，抑制了hUC-EVs-ATO对M1细胞向M2细胞极化；而mTOR抑制剂雷帕霉素刺激BMDM-M1后，hUC-EVs-ATO对M2巨噬细胞极化的促进作用得到加强。表明hUC-EVs-ATO通过以mTOR方式诱导自噬促进M2巨噬细胞极化。
8. BMT后hUC-EVs-ATO保留了GVL效应
保持移植物抗淋巴瘤（GVL）效应是预防血液恶性**复发的关键，为探究hUC-EVs-ATO对GVL效应的影响，将A20-Luc细胞与T细胞耗尽的BM细胞或T细胞耗尽的BM细胞和脾细胞结合移植到BALB/c受体中，接受T细胞的小鼠体内**信号均降低，但没有hUC-EVs-ATO的存在小鼠极终死于aGVHD；接受hUC-EVs-ATO和T细胞的小鼠，存活率明显提高，表明hUC-EVs-ATO减轻了aGVHD，且不损害GVL活性。
讨论：
本研究中作者发现hUC-EVs-ATO可在不影响GVL活性的情况下降低allo-HSCT后的aGVHD。hUC-EVs-ATO通过提高体内外mTOR介导的自噬水平来促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞极化。但hUC-EVs-ATO对mTOR上游通路和自噬代谢通路的影响，及保留GVL效应的具体机制需进一步探究。该研究成果提供了一种降低aGVHD严重程度的新方法，同时保留有益的GVL效应。