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公司新闻/正文
【J Extracell Vesicles】17分+，富含HAX1的细胞外囊泡通过调节ITGB6翻译促进血管生成
616 人阅读发布时间：2022-10-10 14:20
鼻咽cancer(NPC)是起源于鼻咽粘膜内层的上皮cancer，具有高度的侵袭性和转移性。HS1相关蛋白X-1(HAX1)可与各种蛋白质和mRNA的3’-UTR相互作用发挥复杂的生物学作用，其过表达与tumour患者的不良预后有关。
越来越多的证据表明，EV通过多种机制参与各种人类疾病的进展，南通大学附属医院尤易文课题组前期研究发现富含HAX1的EV与NPC的转移有关，但其促进NPC血管生成的分子机制尚未阐明，今年5月他们通过动物和细胞模型深入探讨了其中的分子机制，并在J Extracell Vesicles(IF:17.338)上发表了该成果
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9077140/
技术路线：
实验结果：
1. HAX1上调促进NPC转移和血管生成
为验证HAX1在NPC进展中的作用，作者利用IHC、TCGA和CD31 IHC计算NPC中MVD，结果显示HAX1的高表达与晚期NPC、患者不良预后及高MVD正相关。从多种NPC细胞中筛选出高表达和中低表达HAX1的CNE2和6-10B细胞用于后续研究。两细胞中通过慢病毒转导shHAX1和GFP-HAX1，建立BALB/c小鼠模型，发现shHAX1明显抑制了CNE2和6-10B细胞的转移能力。将DiL-CNE2细胞注射到斑马鱼的主静脉中，3天后，shHAX1组斑马鱼尾部转移性tumour细胞数量低于NC组。表明NPC中HAX1表达影响NPC进展和血管生成。
2. 富含HAX1的EV促进NPC的血管生成
如下图所示，建立NPC和HUVEC共培养系统，来研究HAX1在血管生成中的作用，发现与NC组相比，CNE2-shHAX1组共培养的HUVEC血管生成和迁移能力明显降低。GW4869的处理，能明显抑制CNE2-NC促进血管生成。从转染GFP-HAX1的CNE2细胞中分离EV，与HUVEC共孵育，在HUVEC中可观察到绿色信号，说明HUVEC摄取了富含HAX1的EV。
提取CNE2-NC和CNE2-shHAX1细胞EV，注入斑马鱼胚胎或鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)中，发现EV-shHAX1明显抑制了CAM和斑马鱼胚胎的血管生成。将带Luc信号的CNE2和6-10B细胞注入裸鼠尾静脉中，再给予EV-NC、EV-shHAX1和EV-GFP-HAX1，来探究EV-HAX1是否促进转移，结果显示，EV-shHAX1组的远端转移灶较少，EV-GFP-HAX1组的远端转移灶较多。经患者血清EV丰度的分析，发现EV的密度与疾病进展和患者预后没有明显统计学相关性，说明EV的功能并不取决于其数量或其中HAX1的含量。
在HUVEC细胞中敲低HAX1后，能明显抑制其迁移和管形成能力，同时抑制HUVEC的体内血管生成能力。表明HAX1对血管生成起到关键作用。为分析其表达是否是血管特异性的，作者进行了HPA数据库分析，发现HAX1在一些具有很强再生能力的组织和细胞中高表达，如肝、直肠和精母细胞，且可能在未成熟血管中高表达。
斑马鱼胚胎原位杂交结果显示，HAX1在24hpf之前主要表达与大脑、主静脉和发育中的血管中，但随着斑马鱼的成熟，其血管中HAX1的表达逐渐降低。为验证HAX1在体内血管发育中的作用，在斑马鱼胚胎中注射HAX1 mRNA或HAX1 ATG‐targeting morphants（抑制HAX1），与Ctrl组相比，HAX1 mRNA组肠下血管出现较多分支，而MO-HAX1组的节间和头部血管明显缺失。同样CRISPR/Cas9敲除斑马鱼中的HAX1后，血管发育延迟，节间血管支架明显小于Ctrl组，与MO-HAX1作用一致。
4. HAX1促进HUVEC中的蛋白质翻译
为探究其潜在机制，对野生型和HAX1-KO斑马鱼进行全转率组测序，结合通路富集分析和TCGA分析，发现HAX1与血管形成基因的表达无明显相关性。因此猜测可能通过调节蛋白质翻译参与血管生成。对新生蛋白质合成进行分析，发现shHAX1-HUVEC蛋白质合成水平明显降低，不利于多核糖体的形成，降低了eIF4E和磷酸化4EBP1的水平。经IP-MS和co-IP分析发现HAX1与eIF4E相互作用，且在4EGI的作用下，HAX1促进HUVEC迁移和管形成的能力被明显抑制。
5. HAX1调节HUVECs中ITGB6 mRNA的翻译
为了解HUVEC的血管生成依赖于HAX1的翻译调节作用，对shHAX1和Ctrl的HUVEC进行核糖体分析，发现在shHAX1组的核糖体中有2497个基因翻译受到下调，2375个基因的翻译受到上调，且观察到eIF4E的TE明显下降。
对2497个上调的转录本进行通路富集分析，发现主要涉及PI3K信号通路、粘着斑和ECM-受体相互作用等，整合素家族在这些途经中均富集，其中ITGB6受到HAX1影响max。通过WB证实shHAX1抑制了ITGB6的表达及FAK的磷酸化。利用C15H23NO₄处理HUVEC，证明HAX1不影响ITGB6的半衰期；用MG132进一步证实HAX1影响了ITGB6的翻译效率。
6.HAX1通过FAK通路促进NPC的血管生成和转移
通过挽救实验发现，PF573228(FAK抑制剂)和ITGB6的敲低可抑制HAX1诱导的FAK磷酸化，过表达ITGB6挽救了细胞迁移和血管生成，但被shHAX1抑制。体内结果与体外一致，PF573228和ITGB6的敲低抑制了HAX1促进的NPC转移。
结论：
本研究阐明了HAX1在晚期NPC中高表达，与患者不良预后和MVD正相关，且在具有活跃增殖的组织中高表达。实验表明HAX1表达增加会促进NPC转移，且在血管发育过程中会有一个HAX1高表达阶段。来源于NPC的EV通过携带HAX1促进内皮细胞中ITGB6的翻译效率，唤醒FAK通路，从而影响血管生成，促进NPC转移。作者的成果表明，HAX1可用作NPC转移的重要生物标志物，为临床环境中的抗血管生成诊治提供新的基础。
越来越多的证据表明，EV通过多种机制参与各种人类疾病的进展，南通大学附属医院尤易文课题组前期研究发现富含HAX1的EV与NPC的转移有关，但其促进NPC血管生成的分子机制尚未阐明，今年5月他们通过动物和细胞模型深入探讨了其中的分子机制，并在J Extracell Vesicles(IF:17.338)上发表了该成果
技术路线：
实验结果：
1. HAX1上调促进NPC转移和血管生成
为验证HAX1在NPC进展中的作用，作者利用IHC、TCGA和CD31 IHC计算NPC中MVD，结果显示HAX1的高表达与晚期NPC、患者不良预后及高MVD正相关。从多种NPC细胞中筛选出高表达和中低表达HAX1的CNE2和6-10B细胞用于后续研究。两细胞中通过慢病毒转导shHAX1和GFP-HAX1，建立BALB/c小鼠模型，发现shHAX1明显抑制了CNE2和6-10B细胞的转移能力。将DiL-CNE2细胞注射到斑马鱼的主静脉中，3天后，shHAX1组斑马鱼尾部转移性tumour细胞数量低于NC组。表明NPC中HAX1表达影响NPC进展和血管生成。
2. 富含HAX1的EV促进NPC的血管生成
如下图所示，建立NPC和HUVEC共培养系统，来研究HAX1在血管生成中的作用，发现与NC组相比，CNE2-shHAX1组共培养的HUVEC血管生成和迁移能力明显降低。GW4869的处理，能明显抑制CNE2-NC促进血管生成。从转染GFP-HAX1的CNE2细胞中分离EV，与HUVEC共孵育，在HUVEC中可观察到绿色信号，说明HUVEC摄取了富含HAX1的EV。
提取CNE2-NC和CNE2-shHAX1细胞EV，注入斑马鱼胚胎或鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)中，发现EV-shHAX1明显抑制了CAM和斑马鱼胚胎的血管生成。将带Luc信号的CNE2和6-10B细胞注入裸鼠尾静脉中，再给予EV-NC、EV-shHAX1和EV-GFP-HAX1，来探究EV-HAX1是否促进转移，结果显示，EV-shHAX1组的远端转移灶较少，EV-GFP-HAX1组的远端转移灶较多。经患者血清EV丰度的分析，发现EV的密度与疾病进展和患者预后没有明显统计学相关性，说明EV的功能并不取决于其数量或其中HAX1的含量。
3. HAX1在体内和体外均影响血管生成
在HUVEC细胞中敲低HAX1后，能明显抑制其迁移和管形成能力，同时抑制HUVEC的体内血管生成能力。表明HAX1对血管生成起到关键作用。为分析其表达是否是血管特异性的，作者进行了HPA数据库分析，发现HAX1在一些具有很强再生能力的组织和细胞中高表达，如肝、直肠和精母细胞，且可能在未成熟血管中高表达。
为探究其潜在机制，对野生型和HAX1-KO斑马鱼进行全转率组测序，结合通路富集分析和TCGA分析，发现HAX1与血管形成基因的表达无明显相关性。因此猜测可能通过调节蛋白质翻译参与血管生成。对新生蛋白质合成进行分析，发现shHAX1-HUVEC蛋白质合成水平明显降低，不利于多核糖体的形成，降低了eIF4E和磷酸化4EBP1的水平。经IP-MS和co-IP分析发现HAX1与eIF4E相互作用，且在4EGI的作用下，HAX1促进HUVEC迁移和管形成的能力被明显抑制。
5. HAX1调节HUVECs中ITGB6 mRNA的翻译
为了解HUVEC的血管生成依赖于HAX1的翻译调节作用，对shHAX1和Ctrl的HUVEC进行核糖体分析，发现在shHAX1组的核糖体中有2497个基因翻译受到下调，2375个基因的翻译受到上调，且观察到eIF4E的TE明显下降。
6.HAX1通过FAK通路促进NPC的血管生成和转移
通过挽救实验发现，PF573228(FAK抑制剂)和ITGB6的敲低可抑制HAX1诱导的FAK磷酸化，过表达ITGB6挽救了细胞迁移和血管生成，但被shHAX1抑制。体内结果与体外一致，PF573228和ITGB6的敲低抑制了HAX1促进的NPC转移。
结论：
本研究阐明了HAX1在晚期NPC中高表达，与患者不良预后和MVD正相关，且在具有活跃增殖的组织中高表达。实验表明HAX1表达增加会促进NPC转移，且在血管发育过程中会有一个HAX1高表达阶段。来源于NPC的EV通过携带HAX1促进内皮细胞中ITGB6的翻译效率，唤醒FAK通路，从而影响血管生成，促进NPC转移。作者的成果表明，HAX1可用作NPC转移的重要生物标志物，为临床环境中的抗血管生成诊治提供新的基础。