【Mol Cancer】37+，外泌体衍生的circCCAR1促进肝细胞癌中CD8 +T细胞功能障碍和抗PD1耐药性

       环状RNAs(circRNAs)可以被包裹在外泌体中参与细胞间通讯，影响多种肿瘤的恶性进展。CD8 + T细胞功能障碍是肝细胞癌(HCC)免疫逃逸的主要因素。但外泌体衍生的circRNA对CD8 +T细胞功能障碍的影响还需要进一步探索。在【Mol Cancer】期刊上发表的一篇题为“Exosome-derived circCCAR1 promotes CD8 + T-cell dysfunction and anti-PD1 resistance in hepatocellular carcinoma”的文章中，作者首先发现了一个新的circ_0000240 (circCCAR1)，并发现circCCAR1/miR-127-5p/WTAP反馈回路可以促进HCC的生长和转移。HCC细胞释放的外泌体circCCAR1通过阻止程序性细胞死亡1（PD1）降解促进CD8 + t细胞功能障碍，增强了HCC对抗PD1治疗的耐药性。因此，作者的研究结果揭示了circCCAR1在HCC进展中的功能，为研究circrna在HCC免疫治疗中的功能奠定了基础。

 

   研究结果

1. CircCCAR1在HCC组织中升高

图1A：聚类热图显示健康受试者和HCC患者血清外泌体中的异常circRNAs，其中CircCCAR1在HCC患者血清外泌体中表达水平最高。

图1B：采用不同引物的RT-PCR方法，从HCCLM3细胞的cDNA或基因组DNA (gDNA)中扩增circCCAR1，后剪接连接序列经Sanger测序验证。

图1C：用Dactinomycin处理HCCLM3细胞一段时间后，发现circCCAR1比线性CCAR1转录本更稳定。

图1D：RNase R消化结果显示，与线性宿主基因CCAR1相比，circCCAR1对RNase R酶消化具有抗性。

图1E-F：通过核/细胞质分离实验和RNA荧光原位杂交(FISH)实验观察circCCAR1在HCC细胞系中的亚细胞分布，发现大多数circCCAR1优先定位在细胞质中。

图1G-I：通过FISH和qRT-PCR检测发现，与邻近正常组织相比，HCC患者肿瘤组织中的circCCAR1表达上调。

图1J：生存分析表明，circCCAR1水平升高的HCC患者预后不良。

图1K：RT-QPCR检测正常人肝癌细胞系LO2细胞和HCC细胞系中circCCAR1的表达水平，结果显示circCCAR1在HCC细胞系表达更高。

 

2.CircCCAR1在体内和体外都能促进HCC的生长

图2A-B：在circCCAR1过表达或缺失后的HCC细胞中进行CCK-8检测，结果显示HCC细胞中circCCAR1的敲低可显著抑制细胞活力。

图2C：在circCCAR1过表达或缺失后的HCC细胞中进行集落形成实验，过表达circCCAR1可显著促进HCCLM3和SK-Hep-1细胞的增殖。此外，circCCAR1的下调会损害HCCLM3和SK-Hep-1细胞的集落形成能力，而circCCAR1的过表达则会产生相反的效果。

图2D-F：异种移植肿瘤照片（D），异种移植肿瘤生长曲线（E），测定肿瘤重量（F）。结果显示过表达circCCAR1促进了异种移植肿瘤的生长，而circCCAR1缺失抑制了肿瘤在体内的生长。

图2G：异种移植瘤Ki67染色，结果显示来自circCCAR1过表达细胞的异种移植物显示Ki67的表达增加，而circCCAR1敲低则表现出相反的效果。

 

3.CircCCAR1在体内和体外都能促进HCC的转移

 

 

图3A-C：通过伤口愈合和Transwell迁移实验评估circCCAR1对HCC细胞迁移的功能，结果显示circCCAR1缺失减少了HCC细胞的迁移，而circCCAR1过表达增强了HCC细胞的迁移。

图3D：Transwell侵袭实验表明过表达circCCAR1会增加HCC细胞的侵袭能力，而敲低circCCAR1的表达会降低HCC细胞的侵袭能力。

图3E：小鼠肺转移大体观察结果显示，circccar1过表达组100%的小鼠出现转移性结节，而载体组44%的小鼠最终发现转移性结节。

图3F：计算转移结节数量，数据显示，在circCCAR1缺失组中，只有11%的小鼠发现转移性结节。

图3G：肺切片进行H&E染色，结果显示circccar1过表达组的肿瘤结节数量更多，而circccar1缺失组的肿瘤结节数量更少。

 

4.EP300介导的H3K27ac促进circCCAR1在HCC中的表达

 

图4A：利用ENCODE分析HepG2细胞CCAR1启动子区域的H3K27ac信号，在CCAR1启动子区域发现了丰富的组蛋白H3K27ac信号，表明组蛋白乙酰化可能控制circCCAR1或CCAR1的表达。

图4B：ChIP-qPCR检测在LO2、HCCLM3和SK-Hep-1细胞中CCAR1启动子中的H3K27ac信号，结果显示富集的H3K27ac位于CCAR1启动子中，并且在HCC细胞系中比在对照LO2细胞中更高。

图4C-D：qRT-PCR检测C646或DMSO处理肝癌细胞48 h后CCAR1 mRNA和circCCAR1的表达，结果显示组蛋白乙酰转移酶(HAT)抑制剂C646降低了CCAR1 mRNA和circCCAR1水平。

图4E：TCGA肝细胞癌中EP300与CCAR1的相关性分析，结果显示E1A结合蛋白EP300与TCGA HCC组织中CCAR1的表达呈正相关。

图4F-G：EP300缺失后检测了HCC细胞中circCCAR1的表达，结果显示EP300的抑制显著降低CCAR1 mRNA和circCCAR1的表达。

图4H：EP300缺失后降低了HCC细胞中EP300和CCAR1蛋白水平。

图4I：ChIP-qPCR检测在LO2、HCCLM3和SK-Hep-1细胞中CCAR1启动子中的EP300信号，结果显示富集的EP300位于CCAR1启动子中，并且在HCC细胞系中比在对照LO2细胞中含量更高。

图4J-K：ChIP-qPCR检测在EP300沉默的HCC细胞中CCAR1启动子中的H3K27ac信号，结果显示EP300缺失降低了CCAR1启动子上占用的H3K27ac。

 

5.EIF4A3促进了circCCAR1的环化和核输出

 

图5A：选择circCCAR1 pre-mRNA中的5个位点(a -e)设计qPCR引物，构建含有EIF4A3结合位点的3个质粒(A1-A3)，拉下EIF4A3蛋白。

图5B：通过RIP实验证实EIF4A3与circCCAR1 pre-mRNA的相互作用，发现EIF4A3结合了一个上游推定结合位点、一个后剪接连接位点和一个下游推定结合位点。

图5C：MS2 RNA pull down实验结果证实EIF4A3与circCCAR1的上下游序列结合。

图5D-E：检测肝细胞癌组织及其癌旁组织中EIF4A3水平，计算肝癌样本中EIF4A3与circCCAR1水平的关系。结果显示在HCC样本中EIF4A3水平升高，且circCCAR1与HCC内部样本中EIF4A3表达呈正相关。

图5F：肝癌患者中EIF4A3表达与总生存率的关系，结果显示高水平EIF4A3的HCC患者总生存时间较短。

图5G-H：EIF4A3缺失或过表达的HCCLM3和SK-Hep-1细胞中circCCAR1的表达结果显示EIF4A3过表达使HCC细胞中的circCCAR1水平升高，EIF4A3缺失使HCC细胞中的circCCAR1水平降低。

图5I：RIP实验表明circCCAR1可以被抗EIF4A3抗体拉低。

图5J：RNA-pull down实验表明EIF4A3蛋白在circCCAR1探针复合物中富集。

图5K-M：采用核质分离实验和FISH-IF实验评估EIF4A3耗损后肝癌细胞中circCCAR1的细胞质输出，发现EIF4A3敲除后HCC细胞的细胞质circCCAR1水平明显降低。

 

6.WTAP介导的m6A修饰通过IGF2BP3增强circCCAR1的稳定性

 

图6A：circCCAR1中m6A富集。

图6B：图中显示了circCCAR1中综合得分高的m6A基序的位置。

图6C：用MAO-circCCAR1或MAO-NC处理后HCC细胞中CircCCAR1的水平。

图6D-E：RIP和RNA pull down验证circCCAR1与WTAP、IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3之间潜在的相互作用。结果表明这四种蛋白都被发现在circCCAR1复合体中富集

图6F-G：肝癌细胞WTAP敲除后circCCAR1中m6A和IGF2BP3的富集，结果表明WTAP敲低显著降低了circCCAR1的m6A修饰和IGF2BP3与circCCAR1的结合。

图6H：WTAP敲低或IGF2BP3敲低后可以降低HCC细胞中的CircCCAR1水平。

图6I：WTAP过表达或IGF2BP3敲低后HCC细胞中的CircCCAR1水平，结果表明WTAP过表达可增强circCCAR1水平，而IGF2BP3敲低可逆转WTAP过表达诱导的circCCAR1水平升高。

图6J：Dactinomycin 处理下WTAP过表达或IGF2BP3敲低后肝癌细胞中circCCAR1的稳定性，结果表明WTAP过表达增加了circCCAR1的稳定性，IGF2BP3敲低则降低了circCCAR1的稳定性。

 

7.hnRNPA2B1介导的circCCAR1包装到外泌体

 

图7A-C：透射电镜检测、NanoSight颗粒跟踪分析、Western Blot检测外泌体标志蛋白CD63和TSG101。

图7D：肝癌患者和健康供者血清外泌体中circCCAR1的水平，在HCC患者的血清中检测到外泌体中较高水平的circCCAR1。

图7E：采用Spearman相关分析评估显示肿瘤组织中circCCAR1水平与HCC患者血清中外泌体circCCAR1水平呈正相关。

图7F：肝癌患者外泌体circCCAR1水平与总生存率的关系，表明血清外泌体circCCAR1可作为预后指标。

图7G：检测LO2细胞和HCC细胞培养液外泌体中circCCAR1的表达水平，结果显示与LO2细胞相比，在HCC细胞培养液中观察到外泌体circCCAR1水平升高。

图7H-I：肝癌细胞或肝癌细胞用GW4869处理的上清分离的外泌体中circCCAR1水平，结果显示GW4869阻断外泌体的形成可显著抑制外泌体circCCAR1的水平，而对HCC细胞中circCCAR1的水平无影响。

图7J：肝癌细胞circCCAR1过表达或缺失后外泌体中circCCAR1的表达水平，结果显示HCC细胞中circCCAR1的过表达增强了外泌体circCCAR1的水平，而circCCAR1的缺失降低了外泌体circCCAR1的水平。

图7K-L：通过RIP和RNA pull-down实验发现circCCAR1可以在HCC细胞中与hnRNPA2B1结合。

图7M-N：circCCAR1在hnrnpa2b1缺失的HCC细胞中表达增强，而在hnrnpa2b1缺失的HCC细胞分泌的外泌体中表达降低。

 

8.外泌体circCCAR1加速抗肿瘤CD8 + T细胞的衰竭

 

图8A：pkh67标记的HCCLM3外泌体(红色)被外泌体被活化的CD8 + T细胞有效吸收。

图8B：采用T细胞介导的杀伤实验来评估活化CD8 + T细胞的细胞毒性，CD8 + T细胞与来自过表达circCCAR1的HCC细胞的外泌体共培养，对HCC细胞的细胞毒性较弱。

图8C-E：外泌体circCCAR1共培养可降低活化CD8 + T细胞穿孔素和颗粒酶B蛋白水平，抑制活化CD8 + T细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的分泌。

图F-G：过表达circCCAR1的HCCLM3细胞外泌体增加了CD8 + T细胞中circCCAR1水平和PD1蛋白表达。

图8H：利用RPISeq工具分析circCCAR1与PD1蛋白之间的潜在相互作用，结果表明circCCAR1和PD1蛋白之间具有很高的结合潜力。

图8I-J：RIP和RNA pull-down实验，结果证实了circCCAR1和PD1在CD8 + T细胞中的相互作用。

图8K：在活化的CD8 + T细胞中，circCCAR1的缺失降低了PD1蛋白水平，而circCCAR1的过表达增加了PD1蛋白水平。

图8L：蛋白酶体抑制剂MG132挽救了CD8 + T细胞中circCCAR1缺失或过表达引起的PD1蛋白表达变化。

图8M：CD8 + T细胞经CHX处理后circCCAR1缺失或过表达后PD1蛋白的稳定性分析，结果表明circCCAR1缺失显著缩短了PD1蛋白的半衰期，circCCAR1过表达延长了CD8 + T细胞中PD1蛋白的半衰期。

图8N：通过泛素化实验发现circCCAR1过表达极大地抑制了PD1蛋白的泛素化，而circCCAR1缺失则增加了PD1蛋白的泛素化。

 

9.CircCCAR1促进HCC对抗PD1治疗的耐药性

 

图9A：构建了HuNSG小鼠异种移植模型，与模拟处理小鼠相比，移植了过表达circCCAR1的HCCLM3细胞的异种移植物的HuNSG小鼠外周血外泌体circCCAR1增加。

图9B：CD8免疫组化染色结果表明，在模拟细胞源性组织中，CD8 + T细胞比circCCAR1过表达细胞源性组织中更多。

图9C-F：Opdivo注射到接受过表达circCCAR1的HCCLM3细胞或模拟细胞的HuNSG小鼠体内。通过观察肿瘤体积、重量以及异种移植物小鼠的存活曲线，发现circCCAR1高表达的异种移植小鼠对抗pd1治疗具有耐药性，存活时间较短。

图9G：CD8免疫组化染色结果显示，HCC组织中CD8 + T细胞的浸润较邻近正常组织减少。

图9H-I：计算circCCAR1与组织中或血清外泌体中CD8阳性细胞数的关系，结果表明HCC组织中circCCAR1和外泌体circCCAR1水平均与CD8 + t细胞频率呈负相关。

图9J：circCCAR1介导的肝癌免疫抑制作用模型。

 

结论：

       研究结果表明，circCCAR1加速了HCC患者的肿瘤进展和免疫逃避。在HCC患者的血清中检测到外泌体中较高水平的circCCAR1。血清外泌体circCCAR1可作为HCC患者的诊断和预后指标。高circCCAR1水平的HCC细胞对抗PD1治疗具有耐药性。这些结果表明外泌体circCCAR1表达可作为HCC抗PD1治疗的一种新的有效标志物。

       综上所述，circCCAR1和CCAR1在HCC中升高，可能是HCC患者的预后因素。circCCAR1/miR-127-5p/WTAP正反回馈调控机制促进HCC的生长和转移。HCC细胞分泌的外泌体circCCAR1可被活化的CD8 + T细胞吸收，并通过增强PD1蛋白的稳定性促进CD8 + T细胞功能障碍。此外，HCC细胞中CCAR1蛋白表达的增加通过结合β-catenin促进PD-L1的转录，这可能增强抗PD1治疗的耐药性。因此，靶向外泌体circCCAR1或CCAR1可能为HCC患者提供一种最大化免疫治疗效果的新策略。