骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是最常见的骨科恶性肿瘤，预后较差。患者骨肉瘤细胞的高铁吸收率提示铁死亡可能与骨肉瘤的进展有关，但其潜在的分子调控作用尚不清楚。基于与外泌体偶联以靶向传递信号的能力，外泌体衍生的微核糖核酸(miRNAs)有可能作为OS的诊断生物标志物。湾湾今天分享一篇发表在【Mol Cancer】上题为“Exosome-mediated miR-144-3p promotes ferroptosis to inhibit osteosarcoma proliferation, migration, and invasion through regulating ZEB1”的研究。在本研究中，作者以外泌体作为miRNA-144-3p的载体，确定miR-144-3p过表达和敲低在调控铁死亡机制中的作用，探讨miR-144-3p与OS铁死亡相关特征的关系，从而研究其具体机制。

研究结果

1.miR-144-3p作为OS关键调控因子及ZEB1作为miR-144-3p下游靶点的鉴定和验证

图1A-B：热图和火山图显示基于数据集GSE28425的OS背景下差异表达基因的概况，结果显示miR-144-3p在OS中异常低表达。

图1C：基于miR-144-3p表达水平进行生存分析，结果显示，与miR-144-3p表达水平高的患者相比，miR-144-3p水平低的患者与较差的生存时间密切相关，这表明miR-144-3p是OS有价值的预后生物标志物。

图1D-E：RT-qPCR检测5个OS细胞系和1个成骨细胞系，以及个人OS组织和癌旁组织样本的关键miRNAs，结果证实了miR-144-3p在OS中的下调，表明miR-144-3p可以被认为是OS中的关键调节因子。

图1F ：miR-144-3p与ZEB1结合位点序列。

图1G：双荧光素酶测定表明miR-144-3p可以结合ZEB1。

图1H-I：RT-qPCR检测5个OS细胞系和1个成骨细胞系以及1个人OS组织和癌旁组织样本的关键mRNAs，结果显示，ZEB1在OS中异常高表达。

图1J：IHC检测60个组织切片的显微镜拍照结果显示，ZEB1在OS中异常高表达。

图1K：根据60例患者对应组织切片的临床资料绘制ZEB1 Kaplan-Meier图。

2.OS介导的外泌体中miR-144-3p的提取验证及miR-144-3p/ZEB1轴的转染与验证

图2A-C:透射电镜检测外泌体的形态图片；NTA检测外泌体的粒径大小和和浓度；Western blot检测外泌体标志物CD63、HSP70、TSG101和calnexin的表达情况，结果均符合外泌体特征。

图2D：共培养实验中，可以在OS细胞中观察到明显的红色荧光染色，证实了外泌体可以作为载体将生物分子运输到细胞中。

图2E外泌体芯片热图显示，与癌旁组织相比，来自人OS组织的外泌体中miR-144-3p的表达显著降低。

图2F-G：RT-qPCR验证I-IV组转染miR-144-3p, V-VIII组转染 ZEB1，结果显示转染效果显著。

图2H：为了验证miR-144-3p对ZEB1的调控作用，通过RT-qPCR检测miR-144-3p过表达组、miR-144-3p敲低组和相应的NC组中ZEB1的表达水平。结果显示，ZEB1的表达与miR-144-3p呈负相关。

3.MiR-144-3p抑制OS增殖、侵袭和迁移

图3A：CCK-8法检测OS细胞的体外生存能力。发现miR-144-3p过表达可导致OS活力水平下降。

图3B：通过transwell实验探讨miR-144-3p对体外OS细胞迁移和侵袭的影响，结果表明h143B细胞中miR-144-3p水平越高，迁移和侵袭倾向越低。

图3C-D：通过MRI评估不同转染组的OS体积，发现miR-144-3p过表达组衍生的OS体积小于相应NC组衍生的OS，这与大体解剖的肿瘤结果相似。

4.MiR-144-3p正调控细胞内铁死亡机制

图4A：通过透射电镜观察细胞内形态学改变，结果显示，miR-144-3p水平较高的OS细胞线粒体形态与其他转染组相比，表现出更明显的凋亡相关异常。

图4B：通过GSH实验观察到与相应的NC组相比，过表达miR-144-3p的OS细胞中GSH/GSSG比例较低。

图4C：通过Fe2+水平测定来确定铁转移稳态与miR-144-3p表达之间的关系，结果表明miR-144-3p可以正向调节OS细胞中的Fe2+水平。

图4D：通过MDA实验观察到相对于NC组，miR-144-3p水平升高，OS细胞的相对MDA水平更为突出。

图4E：通过ROS测定OS细胞内的过氧化应激，miR-144-3p可以显著提高细胞内ROS水平。

图4F-G：通过体外实验的RT-qPCR和Western blot检测转染的OS细胞中凋亡相关分子GPX4、ACSL4和xCT的水平。结果显示miR-144-3p的表达与铁死亡分子ACSL4呈正相关，而抗铁死亡分子xCT和GPX4与miR-144-3p的表达水平呈负相关。

图4H-I：通过体内实验的RT-qPCR和IHC检测铁死亡相关分子GPX4、ACSL4和xCT的水平，结果与体外实验一致。

5.ZEB1正调控OS在体内和体外的增殖、迁移和侵袭

图5A-B：通过CCK-8和transwell检测不同转染组h143B细胞的活力、迁移和侵袭性。结果显示，与NC组相比，ZEB1过表达组OS细胞的活力、迁移和侵袭能力更为突出，表明ZEB1可以正向调节OS细胞的促癌表型。

图5C-D：通过测量基于MRI的体积和基于大体样本的肿瘤大小可以观察到，与匹配的NC组相比，高表达ZEB1的h143B细胞衍生的OS在MRI图像上的体积更突出，大体样本中肿瘤大小更大。

6.ZEB1的表达与细胞内铁死亡水平呈负相关

图6A：通过透射电镜观察到，相对于其他转染组，ZEB1敲低组的线粒体发生了更实质性的铁死亡特异性形态学改变。

图6B：通过GSH实验观察结果显示GSH/GSSG比值与ZEB1表达水平呈正相关。

图6C-E：通过Fe2+水平测定、MDA和ROS水平测定，观察到与NC组相比，ZEB1过表达组细胞内上述铁死亡相关指标水平均显著降低，说明ZEB1通过影响谷氨酰胺代谢及Fe2+、MDA和ROS水平抑制铁死亡。

图6F-G：通过体外实验的RT-qPCR和Western blot检测基于不同转染组的OS细胞，对铁死亡相关分子GPX4、ACSL4和xCT水平，结果显示，过表达ZEB1导致ACSL4表达水平降低，xCT和GPX4表达水平升高。

图6H-I：基于CDTX模型体内实验的RT-qPCR和免疫组化实验与上述体外实验一致。

7.ZEB1通过调节铁死亡来缓解miR-144-3p对OS的影响

图7 A-B：CCK-8和transwell实验结果表明，过表达ZEB1可以挽救miR-144-3p的抑瘤作用，从而促进OS细胞的增殖、迁移和侵袭倾向。

图7C-D：体内实验表明，miR-144-3p的表达增加可以通过调节ZEB1来抑制OS的生长。

图9A-E：通过透射电镜观察线粒体形态，通过测定细胞内GSH/GSSG比值、Fe2+水平、MDA水平和ROS水平。结果显示，ZEB1可以恢复miR-144-3p对铁凋亡相关通路的作用。

图9F-I：在体外和体内实验中，通过RT-qPCR、Western blot和IHC法检测不同转染组的OS细胞和CDTX组织的铁死亡相关分子GPX4、ACSL4和xCT，结果进一步验证了ZEB1可以通过调节铁死亡来挽救miR-144-3p对OS的影响。

结论

本研究证明，外泌体中的miR-144-3p和ZEB1可以通过调节铁死亡机制来调控OS的发展，并且有以下几个优势：首先，采用CDTX模型进行体内实验，可以对生理状况进行近似模拟，从而得出具有坚实临床价值的结论；其次，从OS组织中提取外泌体进行测序，与血清外泌体相比，来自肿瘤局部组织的外泌体能更准确地反映肿瘤微环境的组成，便于进一步研究肿瘤细胞间的通讯及对周围其他细胞的影响；第三，分别上调和下调miR-144-3p和ZEB1，充分验证了铁死亡的多种可能途径，并进行了功能挽救实验，验证了miR-144-3p/ZEB1轴在铁死亡机制中的作用。综上所述，这些发现有助于进一步了解OS的发病机制，并证实了铁死亡相关miRNAs作为抗癌治疗靶点或诊断生物标志物的潜力巨大。此外，随着研究的深入，外泌体不仅可以作为预后标志物，还可以作为治疗OS的治疗工具，这些都需要不断的研究和探索。