外泌体在肿瘤细胞和正常细胞之间的通讯中起着重要作用。得益于其稳定的结构，环状rna (circRNAs)被认为在外泌体介导的细胞间通讯中起着重要作用。在一篇发表在【Cell Death&Disease】上的题为“Exosomal circTGFBR2 promotes hepatocellular carcinoma progression via enhancing ATG5 mediated protective autophagy”的研究中，作者观察到来自饥饿应激THLE-2细胞(Exo-Ts)的外泌体可以增强HCC细胞系Hep3B和Huh -7的保护性自噬，因此专门研究了外泌体含量对肝细胞癌进展的影响，并研究了外泌体含量促进HCC进展的调控靶点和机制。为此，作者进一步对THLE-2细胞及其外泌体进行了高通量测序，发现circTGFBR2 在Exo-Ts中显著过表达。通过体外和体内实验进一步证实了circTGFBR2是Exo-Ts增强HCC细胞保护性自噬抵抗饥饿应激的主要因子。在机制上，circTGFBR2经外泌体递送至HCC细胞后，可通过海绵和诱导miR-205-5p的降解，提高自噬相关蛋白ATG5的表达，从而增强ATG5介导的保护性自噬，促进HCC细胞的进展。circTGFBR2/miR-205-5p/ATG5轴可能成为HCC治疗中有希望的治疗靶点。

研究结果

1.来自饥饿应激THLE-2细胞外泌体增强体外HCC细胞的保护性自噬

图1A：利用EBSS建立THLE-2细胞饥饿应激模型，并通过western blot检测自噬相关蛋白LC3B和p62来评估细胞的自噬强度

图1B-D：通过外泌体表征鉴定来自饥饿应激THLE-2细胞(Exo-Ts)和正常THLE-2细胞(Exo-T)分泌的外泌体。NTA结果显示粒径大小在30-200nm，透射电镜可观察到典型的外泌体结构，Western blot检测结果显示存在CD9、CD63、CD81、LAMP2和TSG101标志物，不存在calnexin。以上结果均符合外泌体表征，表明从THLE-2细胞系中成功分离到了外泌体(Exo-Ts和Exo-T)。

图1E：PKH67标记Exo-Ts后与Hep3B和Huh-7细胞共培养24h，共聚焦结果显示Hep3B和Huh-7细胞中均捕捉到PKH67的荧光信号，表示外泌体被HCC细胞摄取。

图2A：Western blot分析Hep3B和Huh-7细胞分别与正常THLE-2细胞(Exo-T)和饥饿应激THLE-2细胞(Exo-Ts)衍生的外泌体共培养后LC3B和p62的表达情况。结果显示，与Exo-Ts共培养可显著增加Hep3B和Huh -7细胞的LC3B脂化，减少p62的积累，表明饥饿THLE-2细胞的外泌体能够增强其靶HCC细胞的自噬。

图2B：通过透射电镜观察结果显示，Exo-Ts显著增加了HCC细胞中双膜液泡的数量，达到较高水平，表明细胞自噬被激活。

图2C：通过显微镜观察转染Ad-mCherry-GFP-LC3腺病毒后肝癌细胞的自噬通量，结果显示，与Exo-T相比，Exo-Ts显著增加了Hep3B和Huh-7细胞中黄色(自噬体)和红色(自噬体)点的数量，显示出对自噬的促进作用。

图2D：采用流式细胞术Annexin V PI/FITC检测肝细胞凋亡率。结果表明，Exo-Ts显著减少饥饿应激下Hep3B和Huh-7细胞的凋亡，而氯喹(CQ)逆转了这一现象，显著提高了HCC细胞的凋亡率。

图2E：与Exo-Ts单独或与氯喹(CQ)联合共培养后，通过克隆形成试验评估低血清浓度下HCC细胞的增殖。结果显示，与Exo-Ts共培养的HCC细胞形成的菌落数量明显大于对照组的细胞，而CQ能够逆转Exo-Ts的这种作用。

2.环hsa_circ_0005224在Exo-Ts中显著上调，可能是HCC细胞外泌体增强自噬的原因

图3A：火山图显示Exo-Ts与Exo-T两组间显著差异表达的circRNAs。

图3B-C：外泌体中差异表达circRNAs的GO和KEGG分析

图3D：层次聚类分析显示，在截断标准|log2FC | > 2.0和P < 0.05下，差异表达的circRNAs。

图3E：采用qRT-PCR检测术前或未术前TAE患者的HCC肿瘤组织和匹配的瘤周肝组织中候选circRNAs的表达。结果表明，术前接受TAE治疗的患者与未接受TAE治疗的患者相比，hsa_circ_0005224在肿瘤组织和瘤周正常组织中的表达均显著上调。

图3F：采用qRT-PCR检测从血液样本中分离的循环外泌体中候选circRNAs的含量。结果显示，HCC (TAE+)组循环外泌体中hsa_circ_0005224 (circTGFBR2)的水平明显高于正常组和HCC (TAE-)组，表明circTGFBR2可能通过外泌体在HCC患者中传播，特别是在接受TAE治疗的HCC患者中传播。

图3G：设计目标circRNAs剪接序列的siRNAs，并将其转染到THLE-2细胞中，采用qRT-PCR检测候选circRNAs在Exo-T和Exo-Ts中的相对表达变化，结果显示外泌体中相应的circRNAs表达显著下调。

图3H：Western blot分析Hep3B和Huh-7细胞与si-ciRs处理的THLE-2细胞外泌体共培养后LC3B和p62的表达情况，检测结果显示，Exo-Ts中hsa_circ_0005224的敲低消除了其增强HCC细胞自噬的能力。

3.Hsa_circ_0005224 (circTGFBR2)是Exo-Ts增强HCC细胞保护性自噬的关键效应载体

图4A：线性TGFBR2产生的反向剪接转录物示意图，Sanger测序进一步验证了连接位点周围的序列与RNA-seq和CircInteractome数据库的结果一致。

图4B：采用qRT-PCR检测circTGFBR2在与Exo-Ts共培养的HCC细胞中的相对表达变化，结果显示，饥饿应激THLE-2细胞中circTGFBR2的相对表达量显著上调，且远高于HCC细胞，而Exo-Ts显著增加了HCC细胞中circTGFBR2的含量。

图4C：采用qRT-PCR法评估RNA对RNase R的抗性，结果表明，circTGFBR2对RNase R的抗性明显高于TGFBR2和GAPDH。

图4D：采用qRT-PCR法评估ActD(1μg/ml)处理后THLE-2细胞中circTGFBR2和TGFBR2的稳定性，结果显示，当将ActD添加到THLE-2细胞中指定的时间段时，circTGFBR2比其线性对应物稳定得多。

图4E：采用circTGFBR2的收敛引物和发散引物进行扩增，琼脂糖凝胶电泳产物显示，circTGFBR2条带仅在cDNA样品中观察到，而在gDNA中未观察到。

图4F：构建包含前后环形框架的circTGFBR2过表达载体(oe-ciR)。在HCC细胞系中进行的qRT-PCR分析表明，oe- ciR可以准确表达circTGFBR2，但不能表达线性TGFBR2。

图4G：western blot评估细胞的自噬状态，结果显示，Hep3B和Huh-7细胞中过表达circTGFBR2可显著增加LC3脂化，降低p62积累，与Exo-Ts共培养相似，表明HCC细胞自噬激活。

图4H:荧光显微镜观察Hep3B细胞自噬情况,测定结果显示，oe-ciR和Exo-Ts均能增加靶细胞中自噬小体(黄色点)和自噬小体(红色点)的数量，表明自噬通量增强。

图4I：流式细胞术检测Hep3B和Huh-7细胞与指定外泌体单独共培养或与e- ciR共转染的凋亡情况，结果显示，肝癌细胞与Exo-Ts共培养或过表达circTGFBR2可显著抑制饥饿应激下的细胞凋亡。

图4J：采用克隆形成实验评估饥饿应激下HCC细胞的增殖能力，结果证实，在低血清浓度下，circTGFBR2在促进肝癌细胞增殖的Exo-Ts中起着至关重要的作用，在HCC细胞中过表达circTGFBR2可显著促进饥饿应激下肝癌细胞的增殖，有效地挽救了Exo-Ts中circTGFBR2缺乏的作用。

4.CircTGFBR2作为miR-205-5p的海绵

图5A：通过CircInteractome数据库对circTGFBR2与RBPs相互作用进行预测分析，并通过RIP实验验证circTGFBR2与AGO2在HCC细胞中的物理相互作用。结果显示，在AGO2富集的样品中，circTGFBR2的相对水平远高于EIF4A3或IgG富集的样品，这表明circTGFBR2可能通过AGO2蛋白发挥miRNA海绵的作用。

图5B：维恩图显示了从miRanda和RNAhybrid数据库之间的重叠中鉴定出的5个候选miRNAs。

图5C：采用qRT-PCR检测候选miRNAs在HCC细胞中的相对表达量，oe-ciR显著下调miR-205-5p的表达。

图5D：利用横跨circTGFBR2连接位点的反义探针(ciR探针)进行RNA pulldown实验，以确定circTGFBR2与候选miRNAs之间的相互作用。结果证实，miR-205-5p而非其他候选miRNAs在ciR探针的pulldown富集水平上与NC探针相比存在显著差异。

图5E：通过Spearman相关分析，circTGFBR2和miR-205-5p在HCC肿瘤和瘤周正常组织中的表达呈负相关。

图5F：RNA-FISH检测证实了circTGFBR2和miR-205-5p在细胞质中的共定位，表明它们之间存在相互作用。

图5G：双荧光素酶报告试验分析表明，与NC模拟组相比，miR-205-5p模拟物显著降低了circTGFBR2-miR-205-5p野生型组的相对荧光素酶活性，而circTGFBR2-miR-205-5p突变组的荧光素酶活性无显著变化。

图5H:RNA pulldown实验证实，生物素化的miR-205-5p野生型组比其突变型组可以显著富集HCC细胞中过表达的circTGFBR2。

图5I：qRT-PCR结果显示，HCC细胞中miR-205-5p的含量在circTGFBR2过表达或抑制时与circTGFBR2的表达呈负相关，而circTGFBR2的含量与miR-205-5p表达变化无显著相关性。

图5J：western blot评估miR-205-5p在调节HCC细胞自噬中的功能作用，结果显示，HCC细胞的自噬被miR-205-5p inhibitor激活，而被miR-205-5p mimic抑制。

5.外泌体circTGFBR2结合miR-205-5p上调ATG5的转录活性，增强HCC细胞的保护性自噬

图6A：维恩图显示利用RNAhybrid、miRanda和TargetScan三个数据库预测HCC细胞中miR-205-5p的潜在靶基因，并进一步检测自噬相关的ATG5基因。

图6B-C：通过Spearman相关分析证实HCC肿瘤和瘤周正常组织中circTGFBR2与ATG5 mRNA呈正相关，miR-205-5p与ATG5 mRNA表达呈负相关。

图6D-E：qRT-PCR和western blot检测miR-205-5p对HCC细胞中ATG5转录和翻译的调控作用。结果表明，肝癌细胞中Hep3B和hh -7细胞中ATG5 mRNA和蛋白的表达与miR-205-5p的含量呈负相关，而miR-205-5p模拟物诱导的这种下调可以通过circTGFBR2的过表达而逆转。

图6F：双荧光素酶活性分析结果显示，miR-205-5p mimic和ATG5 3’UTR野生型载体共转染293 T细胞后，荧光素酶的相对活性显著降低，而突变载体不存在，说明miR-205-5p可以直接结合ATG5 3’UTR并抑制其活性。

图6G-H：western blot检测Hep3B和Huh -7细胞中自噬标记蛋白(ATG5、LC3II/I和p62)的水平，荧光显微镜观察Hep3B细胞在指定处理后自噬情况，结果显示，ATG5的敲低阻断了肝癌细胞中Exo -Ts增强的自噬，miR-205-5p mimic也是如此，而ATG5的过表达能够挽救miR-205-5pmimic对Exo -Ts增强的自噬的阻断作用。

图6I：流式细胞术Hep3B和Huh-7细胞在指定处理后的凋亡情况，结果显示，ATG5过表达可以弥补miR-205-5p mimic阻断Exo-Ts的作用，从而增强HCC细胞的饥饿抵抗能力。

6.CircTGFBR2在体内显著促进HCC进展和肿瘤细胞自噬

图7A：通过将慢病毒转染Hep3B细胞，构建了稳定过表达circTGFBR2的Hep3B (o-ciR)细胞系。

图7B-C：将Hep3B(oe-ciR)细胞(oe-ciR组)和Hep3B(载体组)细胞(载体组，为阴性对照)皮下注射到BALB/c裸鼠右侧。严密监测小鼠肿瘤生长情况26天后处死，称重肿瘤。结果显示，Hep3B(e- ciR)细胞衍生的肿瘤体积和肿瘤重量均明显大于Hep3B(载体)细胞衍生的肿瘤。

图7D-E：免疫组化染色检测肿瘤组织中Ki-67(以阳性细胞百分比量化)和ATG5(以平均密度量化)的表达。结果显示，oe-ciR组肿瘤组织中Ki-67和ATG5的表达水平显著升高。

图7F-G：通过TUNEL染色检测肿瘤组织中细胞的凋亡情况，结果显示circTGFBR2在HCC中过表达可显著抑制细胞凋亡。

图7H：通过qRT-PCR研究miR-205-5p和ATG5 mRNA表达的含量。结果显示，e-circTGFBR2组的组织中miR-205-5p的表达显著下调，而ATG5 mRNA的表达显著上调。

图7I：通过western blot检测肿瘤组织中ATG5和自噬相关蛋白LC3B、p62表达情况，结果显示，与载体组相比，oe-ciR组的ATG5蛋白表达和自噬水平增加。

图8A-B：对体内植入Hep3B细胞的小鼠进行腹腔注射外泌体。结果显示，Exo-Ts组的肿瘤生长速度和肿瘤大小明显超过Exo-T组，当Exo-Ts (Exo- Tssi - ciR组)中circTGFBR2被敲低时，这种促进作用就消失了。

图8C-D：通过TUNEL染色和Ki-67 IHC染色，结果显示，Exo-Ts组肿瘤组织的存活和增殖状况明显好于其他两组，表明Exo-Ts可以通过circTGFBR2的递送在体内发挥促肿瘤生长的作用。

图8F-G：采用qRT-PCR检测miR-205-5p和ATG5 mRNA在异种移植肿瘤组织中的表达。结果显示，Exo-Ts组肿瘤组织中miR-205-5p表达下调，但在Exo-Ts中敲低circTGFBR2时，miR-205-5p表达恢复。相应地，注射Exo-Ts后，肿瘤组织中ATG5 mRNA含量显著上调，导致肿瘤组织自噬增强。

图8E、H：通过免疫组化分析异种移植肿瘤组织中ATG5的表达，Western blot分析异种移植肿瘤组织中ATG5和自噬相关蛋白LC3B、p62的表达，结果显示，蛋白水平均上调，导致肿瘤组织自噬增强。

结论

总之，作者的研究结果表明，来自饥饿应激肝细胞的外泌体通过增强保护性自噬诱导HCC细胞对饥饿应激的抵抗。作者还报道了肝细胞外泌体通过外泌体circTGFBR2和circTGFBR2/miR-205-5p/ATG5轴增强HCC细胞保护性自噬的新机制，为肝细胞和HCC细胞之间的串聊提供了新的证据，并为HCC治疗提供了潜在的治疗靶点。