流行病学研究显示炎症性肠病(IBD)与血栓形成风险增加之间存在关联。然而，IBD如何影响血栓形成仍然未知。目前的研究表明，在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的IBD小鼠中，中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)的形成显著增加，这反过来又以NETs依赖的方式促进血栓形成。湾湾今天分享的是一篇发表在【Advanced Science】上的题为“Exosomes-transferred LINC00668 Contributes to Thrombosis by Promoting NETs Formation in Inflammatory Bowel Disease”的研究，在本研究中，作者假设炎症肠上皮细胞(IEC)分泌的外泌体可能通过诱导NETs的释放来促进血栓形成。作者确定了负责外泌体诱导NETs形成的重要生物分子，并探索了IEC衍生的外泌体如何促进NETs形成和血栓形成的潜在机制。

研究结果

1.DSS诱导肠道炎症小鼠血栓形成增加与NETs形成相关

图1a：通过尾静脉给药或不给药DNase I (DNase)的对照组或3% DSS (PBS)处理小鼠血栓形成的代表性图像。

图1b：按(a)处理的三组小鼠血管闭塞时间。

图1c：肠系膜静脉的代表性图像，罗丹明6G标记的白细胞和血小板(红色)和FITC‐葡聚糖标记的血流(绿色)。

图1d-e：对照组和DSS组小鼠治疗7天后血浆中性粒细胞计数（d）和血小板计数（e）。通过EDTA抗凝全血用五类血细胞分析仪进行分析。

图1f-g：按(a)处理的小鼠下腔静脉狭窄手术治疗，测量3组采集的血栓重量和长度。

图1H：按(a)处理小鼠尾出血时间。

图1i：利用酶标仪测定红细胞破裂后释放的血红蛋白在550 nm波长处的吸光度，测定失血量。

图1j：采用MPO‐DNA ELISA法测定(a)处理的三组小鼠血浆NETs。

图1k：Ly6G代表性免疫组化染色图像。

图1l：按(a)处理的三组小鼠下腔静脉血栓瓜氨酸组蛋白H3(绿色)和MPO(洋红色)染色。

图1m：下腔静脉狭窄术后2天全血栓中CitH3表达的Western blot分析。

综上所述，得出结论，中性粒细胞以NETs依赖的方式促进血栓形成。

 

2.从DSS诱导的IBD小鼠血浆中分泌外泌体在IBD相关血栓形成中起重要作用

图2a：五组不同处理小鼠血栓形成的代表性图像

图2b：同(a)处理的5组小鼠血管闭塞时间。

图2c-d：按(a)处理的小鼠下腔静脉狭窄手术治疗，48 h后，测量5组小鼠的重量和血栓长度。

图2e：同(a)处理的5组小鼠尾出血时间。

图2f：用酶标仪测定5组小鼠在550 nm波长处的血红蛋白吸光度，测定失血量。图2g：采用MPO‐DNA ELISA法测定5组小鼠血浆中NETs的含量。

图2h： PBS处理小鼠通过尾静脉注射从Ctrl (CtrlEXO)或DSS处理(DSSEXO)小鼠中分离的外泌体，并在下腔静脉狭窄术后2天获得的整个血栓中进行CitH3表达的Western blot分析。

图2i：与(a)相同处理的5组小鼠下腔静脉血栓中CitH3(绿色)和MPO(洋红色)染色。

这些结果表明，使用GW4869抑制外泌体释放可以通过降低外周血和静脉血栓形成中的NETs水平来延缓DSS治疗小鼠的血栓形成。

 

3.发炎的IECs诱导中性粒细胞生成NETs

图3a：通过qPCR分析检测用PBS (Ctrl)、10µg mL−1 LPS (LPS)、50µg mL−1 TNF‐α (TNF‐α)、25µg mL−1 IL‐1β (IL‐1β)、50µg mL−1 IFN‐γ (IFN‐γ)或以上四种因素的混合物(Mix)处理的Caco-2细胞中TNF‐α、CCL2和IL‐6 mRNA的表达。

图3b)：Western blot分析6组(a)处理的Caco‐2细胞中p65和 IκB的表达。

图3c-d： ELISA检测6组(a)处理的Caco‐2细胞培养上清中IL - 6和IL - 8的表达。

图3e)：Western blot分析测定PBS (Ctrl)或Mix处理的Caco‐2细胞中NFκB p65的核和细胞质表达。

图3f)：PBS (Ctrl)或Mix处理的Caco‐2细胞中的p65(绿色)染色，细胞核用DAPI(蓝色)染色。

图3g：Caco- 2细胞(上室)和中性粒细胞(下室)的Transwell共培养系统示意图。

图3h：与Ctrl或Mix处理的Caco-2细胞共培养后中性粒细胞胞外DNA SYTOX Green染色的代表性图像。

图3i：用Ctrl或Mix处理的Caco-2细胞与中性粒细胞共培养，细胞核用DAPI(蓝色)染色，其中CitH3(绿色)和MPO(洋红色)染色。

总的来说，这些数据表明炎症的IECs可以诱导中性粒细胞产生NETs。

 

4.发炎的IECs衍生外泌体促进中性粒细胞释放NETs

图4a：用Ctrl或Mix处理的Caco-2细胞培养上清制备外泌体示意图。

图4b：Western blot检测外泌体分离过程中ER相关蛋白calnexin和外泌体标记物TSG101、CD9和ALIX。

图4c：从Ctrl或Mix处理的Caco-2细胞分离的外泌体的电镜图像。

图4d：从Ctrl或Mix处理的Caco-2细胞分离的外泌体的纳米颗粒跟踪分析。

图4e：对Mix处理的Caco-2细胞上清液、外泌体或微泡处理的中性粒细胞进行CitH3(绿色)和MPO(洋红色)的免疫荧光染色。

图4f：通过测定SYTOX Green在523 nm处的OD来定量NETs的释放，倍增变化归一化到对照上清(Ctrl)。

图4g)将PBS‐、RNase‐、蛋白酶‐、RNase +蛋白酶‐、蛋白酶+ Triton X‐100‐、RNase + Triton X‐100‐、RNase +蛋白酶+ Triton X‐100‐或RNase +蛋白酶+ Triton X‐100‐处理过的外泌体添加到中性粒细胞中，然后通过测量Ex485、Em520处SYTOX Green的荧光检测NETs的定量。

总之，这些结果提供了明确的证据，证明炎症Caco-2细胞分泌的外泌体直接促进中性粒细胞以依赖外泌体RNA的方式释放NETs。

 

5.IEC外泌体诱导NETs形成分子LINC00668的鉴定

图5a：选择并总结经Ctrl或Mix处理的Caco-2细胞外泌体中差异表达的lncRNAs。热图显示显著变化的lncRNAs，用红色(上调)和蓝色(下调)表示。

图5b：qPCR验证显著上调的lncRNAs子集。将其相对表达量归一化为GAPDH。

图5c：利用两个靶向LINC00668不同区域的siRNAs在Caco‐2细胞中敲低LINC00668，通过qPCR检测敲低效率。

图5d：将转染siCtrl或siLINC00668的Caco-2细胞与中性粒细胞共培养4小时，对中性粒细胞进行CitH3(绿色)、MPO(品红)和DAPI(蓝色)的免疫荧光染色。

图5e：通过测量SYTOX Green在Ex485, Em520处的荧光，定量siCtrl或siLINC00668转染的中性粒细胞中的NETs。

图5f：设计构建LINC00668过表达质粒，并通过qPCR验证过表达效率。

图5g：将pcDNA3.1和LINC00668过表达质粒分别转染到中性粒细胞中，用免疫荧光法对中性粒细胞进行CitH3(绿色)、MPO(洋红色)和DAPI(蓝色)染色。

这些结果表明，在IBD患者中，LINC00668的表达和NETs含量的变化与IBD小鼠模型相似，说明LINC00668在IBD患者中发挥的作用与在IBD小鼠模型中相同。

 

6.LINC00668促进NE从细胞质颗粒转运到细胞核并诱导NETs释放

图6a：通过生物素化LINC00668拉降和质谱法鉴定HL - 60细胞中与LINC00668相互作用的蛋白。

图6b：用生物素化的LINC00668或其反义序列(antisence)拉低HL-60细胞中与LINC00668相关的蛋白，并使用抗NE抗体进行Western blotting分析沉淀。

图6c：在过表达LINC00668的HL-60细胞中，用IgG或抗NE抗体拉下RNA -蛋白免疫沉淀，用qRT-PCR检测LINC00668。

图6d：中性粒细胞与从Ctrl(Ctrl‐EXO)或Mix(Mix‐EXO)处理的Caco‐2细胞分离的外泌体孵育，免疫荧光染色检测NE的亚细胞定位。

图6e：用过表达pcDNA3.1或LINC00668的质粒转染中性粒细胞，免疫荧光染色检测NE的亚细胞定位。

图6f：用siCtrl或siLINC00668转染Caco‐2细胞，并用Mix刺激24小时。从培养上清中分离外泌体，用于处理中性粒细胞，并使用免疫荧光染色检测NE亚细胞定位。

图6g：用从Ctrl(Ctrl‐EXO)或Mix (Mix‐EXO) Caco‐2细胞分离的外泌体处理中性粒细胞，用NE和LINC00668荧光原位杂交(FISH)对中性粒细胞进行免疫荧光染色。

图6h： LINC00668序列(Oligo1397‐1445)中1397-1445个核苷酸位置的序列和Oligo1397‐1445序列中结合位点1、2和3的3个突变体(Mut 1、Mut 2和Mut 3)。

图6i：将HL‐60细胞裂解物与生物素化的Oligo1397‐1445、Oligo1397‐1445的反义序列(Anti1397‐1445)或Ctrl孵育，Western blot分析检测Oligo‐蛋白免疫沉淀中的NE水平。

图6j： 将HL‐60细胞裂解物与生物素化的Oligo1397‐1445或结合位点1、2和3 (Mut 1、Mut 2和Mut 3)的突变体一起孵育，Western blot分析检测Oligo‐蛋白免疫沉淀中的NE水平。

这些发现表明，Mix‐EXO中含有的LINC00668促进了中性粒细胞中NE的核易位。

 

7.小檗碱通过阻断LINC00668与NE的结合抑制NETs的形成

图7a：小鼠单独饮水(Ctrl)或3% DSS联合PBS (PBS)或BBR (BBR)腹腔注射后血栓形成的代表性图像。

图7b：按(a)处理的3组小鼠血管闭塞时间。

图7c-d：按(a)处理的小鼠下腔静脉狭窄手术，48 h后，测量3组小鼠的重量和血栓长度。

图7e：尾出血时间见(a)。

图7f：用酶标仪测定血红蛋白在550nm波长处的吸光度，测定失血量。

图7g：采用MPO‐DNA ELISA法测定(a)处理的3组小鼠血浆NETs。

图7h：同(a)处理的3组小鼠下腔静脉血栓形成的血栓中CitH3(绿色)和MPO(洋红色)染色。

图7i：下腔静脉狭窄术后2天全血栓中CitH3表达的Western blot分析。

图7j：中性粒细胞与从Ctrl (Ctrl‐EXO)或Mix处理(Mix‐EXO) Caco‐2细胞分离的外泌体孵育，然后用BBR处理或不处理。对中性粒细胞进行CitH3(绿色)、MPO(品红色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光染色。

图7k：用生物素化的LINC00668(含或不含BBR或其反义序列)拉低HL‐60细胞裂解物，并使用抗NE抗体进行Western blotting分析沉淀。

图7l：在过表达LINC00668的HL-60细胞中，用IgG或抗NE抗体拉下的RNA -蛋白免疫沉淀物中检测LINC00668的qRT - PCR。结果与IgG免疫沉淀物相关。

这些结果表明BBR可以有效抑制NETs的释放和随后的血栓形成。

 

结论

本研究的新发现包括:1)DSS诱导的IBD小鼠的NETs形成显著增加；2)炎症条件下IECs释放的外泌体通过促进中性粒细胞释放NETs促进血栓形成；3)在IECs来源的外泌体中高度富集的LINC00668介导NE从细胞质颗粒向细胞核的易位，从而刺激组蛋白裂解和染色质去浓缩，导致NETs释放；4) BBR通过抑制LINC00668与NE的相互作用，抑制NE的核易位和随后的NETs形成，从而发挥其抗血栓作用。这些观察结果为外泌体介导的NETs形成将IBD和血栓形成联系起来提供了机制解释。