【Protein Cell】21.1，NDFIP1通过外泌体分选限制细胞TAZ积累以抑制NSCLC增殖

NDFIP1先前已被报道为多种实体肿瘤的肿瘤抑制因子，但NDFIP1在NSCLC中的功能及其潜在机制尚不清楚。此外，含有WW结构域的蛋白可以被NDFIP1识别，导致目标蛋白被装载到外泌体中。然而，含有WW结构域的转录调节因子1 (WWTR1，也称为TAZ)是否可以被NDFIP1包装到外泌体中，如果可以，这种致癌蛋白通过外泌体释放是否对肿瘤的发展有影响，目前还没有任何研究。

湾湾今天分享的一篇发表在【Protein &Cell】上的题为“NDFIP1 limits cellular TAZ accumulation via exosomal sorting to inhibit NSCLC proliferation”的研究，该研究中，作者首次发现NDFIP1在NSCLC样本和细胞系中低表达，这与较短的OS有关。然后，确认了TAZ和NDFIP1之间的相互作用，以及TAZ在外泌体中的存在，这需要NDFIP1。关键的是，敲除NDFIP1导致TAZ积累，但其mRNA水平和降解速率没有变化。外泌体分泌可改变细胞TAZ水平。此外，NDFIP1在体外和体内抑制增殖，沉默TAZ消除了NDFIP1敲除引起的增殖增加。此外，在皮下异种移植模型和临床样本中，TAZ与NDFIP1呈负相关，且非小细胞肺癌患者血清外泌体TAZ水平较低。综上所述，该研究数据揭示了NSCLC中一种新的肿瘤抑制因子NDFIP1，以及TAZ的一种新的外泌体相关调控机制。

 

研究结果

1. NDFIP1在NSCLC中低表达，低表达NDFIP1与较短的OS相关

图1A-F：NDFIP1在Oncomine数据库中临时LSQ、LADC、LLC和SLC队列的表达和NDFIP1拷贝数分析。(A)在Hou Lung数据集中的表达； (B) Garber Lung数据集中的表达；(C) Selamat Lung数据集中的表达；(D) Wachi Lung数据集中的表达；(E) TCGA Lung 2数据集中的表达；(F) Weiss Lung数据集中的表达。

图1G：患者1和5肿瘤和肿瘤旁组织中NDFIP1免疫组化结果。

图1H：17对NSCLC组织中NDFIP1的IHC染色强度定量。

图1I：NDFIP1 mRNA在NSCLC组织和匹配的非肿瘤组织中的表达水平(n = 17)。

图1J-M：LADC细胞系、A549、SPC-A1、SPC-A1- BM、LSQ细胞系、H520、HCC95、H2170和支气管上皮细胞系Beas-2B中NDFIP1蛋白和mRNA的表达水平。

图1N-O：NDFIP1水平对肺癌患者总生存期和无进展生存期的Kaplan-Meier分析。

 

2. NDFIP1与TAZ相互作用，负责将TAZ募集到外泌体中

图2A：在SPC-A1和SPC-A1-BM中NDFIP1与TAZ的结合。

图2B：在SPC-A1中TAZ与NDFIP1的反向结合。

图2C：293T中NDFIP1与TAZ的结合。

图2D：NDFIP1在SPC-A1中与TAZ WT结合，而不与TAZ ΔWW结合。

图2E：NDFIP1和TAZ在SPC-A1和SPC-A1-BM中的IF共定位。

图2F：NDFIP1和TAZ在SPC-A1和SPC-A1-bm中的IF共定位。

图2G：SPC-A1外泌体的粒径分布。

图2H：Western Blot检测SPC-A1不同组分中YAP、TAZ、外泌体特异性蛋白、ALIX、TSG101、CD63、细胞内参、GAPDH和高尔基标记物GM130的蛋白水平。

图2I：CD63和TAZ在SPC-A1和SPC-A1-BM中的IF共定位。

图2J-K：对照(sgNC)和NDFIP1敲除(sgNDFIP1)以及对照(PCDH)和NDFIP1过表达(NDFIP1- OE)的SPC-A1细胞的每个细胞分泌外泌体的平均数量。

图2L-M：Western Blot检测对照(sgNC)和NDFIP1敲除(sgNDFIP1)的SPC-A1细胞和对照(PCDH)和NDFIP1过表达(NDFIP1- oe)的SPC-A1细胞中相同数量的外泌体中的TAZ和NDFIP1蛋白水平。

 

1. 3.NDFIP1通过外泌体决定TAZ的细胞积累

图3A、C：Western Blot检测对照(sgNC)和NDFIP1敲除(sgNDFIP1) SPC-A1细胞、对照(PCDH)和NDFIP1过表达(NDFIP1- OE) SPC-A1细胞中TAZ和NDFIP1的蛋白水平。

图3B、D：RT-PCR对照(sgNC)和NDFIP1敲除(sgNDFIP1) SPC-A1细胞、对照(PCDH)和NDFIP1过表达(NDFIP1- OE)四组TAZ相对mRNA水平。

图3E-F：Western Blot检测四组细胞质和细胞核中TAZ和NDFIP1蛋白水平的变化。

图3G-H：CHX追踪实验对四组TAZ的影响。TAZ的相对定量图绘制在右侧。

图3I-J：Western Blot检测有或没有蛋白酶体活性抑制剂MG132和溶酶体活性抑制剂CQ的四组中TAZ和NDFIP1的蛋白水平。

 

4.NDFIP1在体外和体内均抑制NSCLC细胞的增殖

图4A、C)：Western Blot检测增殖标志物PCNA在对照(sgNC)和NDFIP1敲除(sgNDFIP1) SPC-A1细胞、对照(PCDH)和NDFIP1过表达(NDFIP1- OE) SPC-A1细胞中的蛋白水平。  

图4B、D：四组细胞活力测定。

图4E、I：皮下小鼠异种移植瘤模型对照(sgNC)和NDFIP1敲除(sgNDFIP1) SPC-A1细胞，对照(PCDH)和NDFIP1过表达(NDFIP1- OE) SPC-A1细胞的肿瘤图像。

图4F、J：肿瘤的重量。

图4G、K：四组肿瘤的代表性免疫组化图像。ki -67阳性细胞的定量图绘制在右侧。

图4H、L：Western Blot检测肿瘤中PCNA蛋白水平。右侧是PCNA的相对定量图。

 

5.NDFIP1在体内改变细胞内和细胞外TAZ的丰度

图5A-B：Western Blot检测对照(sgNC)和NDFIP1敲除(sgNDFIP1) SPC-A1细胞、对照(PCDH)和NDFIP1过表达(NDFIP1- OE) SPC-A1细胞的小鼠皮下肿瘤中的TAZ蛋白水平。TAZ的相对定量图绘制在右侧。

图5C-D：RT-PCR检测肿瘤中的TAZ mRNA水平。

图5E：TAZ与NDFIP1在这些肿瘤细胞中的线性相关分析。

图5F-G：四组小鼠等量血清外泌体中TAZ蛋白水平。

图5H：小鼠血清单个外泌体TAZ水平与细胞NDFIP1水平的线性相关分析。

图5I：肿瘤细胞中的TAZ与配对小鼠血清中单个外泌体中的TAZ的线性相关分析。

 

6.非小细胞肺癌患者样本中TAZ与NDFIP1表达呈负相关，且非小细胞肺癌患者血清中外泌体TAZ水平较低

图6A：患者1和5肿瘤和瘤旁组织中TAZ的免疫组化。

图6B：17对非小细胞肺癌组织中TAZ的IHC染色强度定量。

图6C：17个非小细胞肺癌组织和匹配的非肿瘤组织中TAZ mRNA水平。

图6D：NSCLC肿瘤组织与旁肿瘤组织中TAZ相对水平与NDFIP1相对水平的线性相关分析。

图6E：人血清外泌体的透射电镜图像。

图6F：人血清外泌体的粒径分布。

图6G：Western Blot检测人血清外泌体中YAP、TAZ、cTAZ、NDFIP1和外泌体特异性蛋白ALIX、CD63、CD9的蛋白水平。

图6H：健康对照组和非小细胞肺癌患者等量血清外泌体中TAZ和NDFIP1蛋白水平的变化。

图6I：健康对照和非小细胞肺癌患者单个外泌体TAZ蛋白水平的相对定量分析。

图6J：人血清单个外泌体TAZ与NDFIP1的线性相关分析。

 

结论

综上所述，NDFIP1在TAZ募集到外泌体中起着至关重要的作用，从而平衡细胞内和细胞外的TAZ水平;NDFIP1作为肿瘤抑制因子，在NSCLC中下调，从而释放细胞增殖抑制的制动器。因此，本研究揭示了NDFIP1的新功能和TAZ的新调控机制，对NSCLC生物标志物的开发和治疗策略具有重要意义。