【Int J Biol Sci】9+,肿瘤源性外泌体ENO2通过调节肿瘤相关巨噬细胞的极化促进弥漫性大B细胞淋巴瘤进展

       弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一种具有显著生物学和临床多样性的疾病，约占成人非霍奇金淋巴瘤的30%-40%。CHOP是DLBCL的最优选化疗方案。抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗的应用显著提高了总生存率。尽管取得了这些进展，但约有20%-40%的病例治疗失败，尤其是复发和耐药患者。因此，寻找新的治疗靶点是相当重要的。

       湾湾今天分享的是发表在【Int J Biol Sci】上题为“Tumor-derived Exosomal ENO2 Modulates Polarization of Tumor-associated Macrophages through Reprogramming Glycolysis to Promote Progression of Diffuse Large B-cell Lymphoma”的研究。该研究通过生物信息学分析和一系列实验研究了DLBCL来源的外泌体ENO2在DLBCL进展过程中调节巨噬细胞极化的作用和相关机制。生物信息学分析结果显示，ENO2高表达与DLBCL进展及巨噬细胞M2/M1比值呈正相关。DLBCL患者血清外泌体及DLBCL细胞中ENO2蛋白水平升高。此外，DLBCL衍生的外泌体被巨噬细胞同化，然后调节巨噬细胞的极化。体外和体内实验结果表明，DLBCL来源的外泌体ENO2调节巨噬细胞极化(M2表型增加，M1表型减少）从而促进DLBCL的增殖、迁移和侵袭。随后发现DLBCL来源的外泌体ENO2对巨噬细胞极化的调节依赖于糖酵解，并通过GSK3β/β-catenin/c-Myc信号通路促进。这些研究结果表明，DLBCL来源的外泌体ENO2通过GSK3β/β-catenin/c-Myc信号通路加速糖酵解，最终促进巨噬细胞向M2表型发展，从而促进DLBCL的增殖、迁移和侵袭，提示外泌体ENO2可能是DLBCL有希望的治疗靶点和预后生物标志物。

 

研究结果

1.ENO2高表达水平预示DLBCL预后不良，并与TME中巨噬细胞M2/M1比值升高相关

图1A-B：ENO2高或低表达的GSE10846和GSE32918队列DLBCL患者的OS Kaplan-Meier分析。

图1C：ENO2高或低表达的GSE119214队列FL患者的OS Kaplan-Meier分析。

图1D-E：ENO2在GSE9732和GSE32918队列中的表达特征。

图1F：来自人类蛋白质图谱的代表性ENO2 IHC染色图像。

图1G-L：ENO2表达水平与T细胞CD8、T细胞调控、巨噬细胞M0、巨噬细胞M1、巨噬细胞M2及巨噬细胞M2/M1比值的相关性。

 

2.DLBCL患者血清及DLBCL细胞外泌体ENO2升高

图2A-C：TEM和NTA鉴定外泌体形状和粒径大小。

图2D：Western blot检测外泌体ENO2表达水平。结果显示DLBCL患者血清外泌体ENO2升高，与DLBCL的进展有关。

图2E：DLBCL细胞和外泌体中的ENO2蛋白水平均高于NCs的B淋巴细胞。

图2F-G：共聚焦显微镜图像显示THP-1巨噬细胞从DLBCL细胞摄取外泌体。外泌体(绿色)，F-肌动蛋白(红色)和细胞核(蓝色)。

图2H：THP-1巨噬细胞中IL-10、TGF-β、IL-12p40、TNF-α mRNA水平的变化。

图2I：THP-1巨噬细胞上清中IL-10、IL-12p40水平。

图2J：CD68+CD206+THP-1巨噬细胞比例及定量分析。

 

3.DLBCL来源的外泌体被THP-1巨噬细胞吸收，并通过ENO2调节巨噬细胞极化

图3A-B：建立了ENO2稳定转染的DLBCL细胞。不同稳定转染的DLBCL细胞外泌体浓度无显著差异。

图3C：THP-1巨噬细胞中IL-10、TGF-β、IL-12p40、TNF-α mRNA水平的变化。

图3D：THP-1巨噬细胞上清中IL-10、IL-12p40水平。

图3E-H：CD68+CD206+THP-1巨噬细胞比例及定量分析。

 

4.DLBCL来源的外泌体ENO2在体内和体外均可促进巨噬细胞向M2样表型转变，从而促进DLBCL细胞的增殖、迁移和侵袭

图4A-B：CCK8显示DLBCL细胞的增殖能力。

图4C-D：Transwell实验显示DLBCL细胞的迁移和侵袭能力。裸鼠皮下注射SU-DHL-2-ENO2-sh1细胞，每隔一天通过尾侧静脉注射稳定转染不同ENO2的SU-DHL-2细胞外泌体，共14次，共4周。

图4E：SU-DHL-2-ENO2-sh1异种移植瘤体积。

图4F：SU-DHL-2-ENO2-sh1异种移植物生长速度。

图4G：SU-DHL-2-ENO2-sh1异种移植瘤的肿瘤重量。

图4H：SU-DHL-2-ENO2-sh1异种移植瘤的免疫组化染色图像(CD206)。

 

5.DLBCL来源的外泌体ENO2对巨噬细胞极化的调节依赖于糖酵解

图5A：THP-1巨噬细胞的葡萄糖消耗。

图5B：THP-1巨噬细胞ATP的产生。

图5C：THP-1巨噬细胞的乳酸生成。

图5D-E：THP-1巨噬细胞的ECAR。用不同浓度的2-DG处理THP-1巨噬细胞1小时，然后用上调ENO2的外泌体刺激THP-1巨噬细胞24小时。检测巨噬细胞极化标记物。

图5F：THP-1巨噬细胞中IL-10、TGF-β、IL-12p40、TNF-α mRNA水平的变化。

图5G： THP-1巨噬细胞上清中IL-10、IL-12p40水平。

图5H-I：CD68+CD206+THP-1巨噬细胞比例及定量分析。

 

6.DLBCL来源的外泌体ENO2通过GSK3β/β-catenin/c-Myc信号通路加速糖酵解，从而调节巨噬细胞极化

图6A-B：不同ENO2稳定转染的DLBCL细胞外泌体刺激THP-1巨噬细胞，检测p-GSK3β(Ser9)、β-catenin和c-Myc蛋白的表达水平;ICG001可降低THP-1巨噬细胞中β-catenin和c-Myc的蛋白表达水平;SKL2001可提高THP-1巨噬细胞中β-catenin和c-Myc的蛋白表达水平。用ICG001或SKL2001处理THP-1巨噬细胞1小时，然后用DLBCL细胞外泌体刺激24小时。检测糖酵解相关指标。

图6C：THP-1巨噬细胞的葡萄糖消耗。

图6D：THP-1巨噬细胞ATP的产生。

图6E：THP-1巨噬细胞的乳酸生成。

图6F-G：THP-1巨噬细胞的ECAR。

图7A：THP-1巨噬细胞中IL-10、TGF-β、IL-12p40、TNF-α mRNA水平的变化。

图7B：THP-1巨噬细胞上清中IL-10、IL-12p40水平。

图7C：CD68+CD206+THP-1巨噬细胞比例及定量分析。

 

结论

综上所述，DLBCL衍生的外泌体可以被巨噬细胞摄取，并且DLBCL衍生的外泌体ENO2通过GSK3β/ β-catenin/c-Myc信号通路加速糖酵解，调节巨噬细胞向免疫抑制表型发展，从而促进DLBCL的进展。认识到DLBCL衍生的外泌体ENO2在调节TAMs极化中的关键作用，为DLBCL治疗提供了潜在的分子靶点。