【Advance Science】15+，肿瘤外泌体ENPP1水解cGAMP抑制cGAS-STING信号传导

       为了逃避免疫监视，肿瘤细胞在其膜表面表达外核苷酸热磷酸酶磷酸二酯酶1 (ENPP1)，该酶降解细胞外环GMP-AMP (cGAMP)，从而抑制干扰素基因(STING) DNA感应途径的环GMP-AMP合成酶(cGAS)刺激物。为了充分了解这种肿瘤隐身机制，有必要确定肿瘤微环境中是否存在具有水解cGAMP活性的其他形式的ENPP1来调节这种先天免疫途径。

       湾湾今天分享的是发表在【Advance Science】上题为“Tumor Exosomal ENPP1 Hydrolyzes cGAMP to Inhibit cGAS‐STING Signaling”的研究，该研究报道多种肿瘤源性外泌体携带ENPP1，可水解合成2'3'-cGAMP和细胞产生的内源性2'3'-cGAMP，抑制免疫细胞中的cGAS‐STING通路。此外，肿瘤外泌体ENPP1还能水解与LL-37（2'3'-cGAMP的有效转运体）结合的2'3'-cGAMP，从而抑制STING信号传导。此外，从人乳腺癌和肺癌组织分离的外泌体中观察到ENPP1的高表达，肿瘤外泌体ENPP1抑制CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的免疫浸润。这些结果阐明了肿瘤外泌体ENPP1在cGAS‐STING通路中的重要功能，进一步了解了肿瘤细胞与免疫系统之间的串扰。

 

研究结果

1.肿瘤源性外泌体表达ENPP1并水解2'3'-cGAMP/LL-37-2'3'-cGAMP

图1A：A375细胞来源外泌体（A375 EXOs）透射电镜图像。

图1B：A375 EXOs NTA粒径大小分布。

图1C：Western blot分析不同肿瘤细胞系全细胞裂解液(W)和外泌体(E)中总蛋白含量相同的ENPP1。使用Image J软件通过Western blot灰色值分析不同肿瘤源性外泌体中ENPP1的相对强度。

图1D：用抗ENPP1抗体免疫金标记的A375 EXOs代表性透射电镜图像。

图1E：流式细胞分析外泌体中ENPP1的表达。

图1F：肿瘤外泌体ENPP1水解2'3'-cGAMP后，ELISA测定残留2'3'-cGAMP浓度示意图。

图1G：来自经或未经ENPP1-IN-1/GM处理的A375、A549、MDA-MB-231和SW480细胞的外泌体和2'3'-cGAMP共孵育不同时间残留2'3'-cGAMP与初始2'3'-cGAMP的百分比。

图1H：外泌体LL-37和2'3'-cGAMP共孵育不同时间残留2'3'-cGAMP与初始2'3'-cGAMP的百分比。

        这些结果表明了各种肿瘤来源的外泌体携带ENPP1蛋白，并且肿瘤外泌体ENPP1可以水解2'3'-cGAMP和LL-37-2'3'-cGAMP。

 

2.肿瘤外泌体ENPP1通过水解2'3'-cGAMP抑制cGAS-STING信号传导

图2A：肿瘤源性外泌体介导的THP1 - Lucia ISG细胞免疫应答实验示意图。在STF-1623缺失或存在的情况下，用肿瘤来源的外泌体和2'3'-cGAMP处理THP1-Lucia ISG细胞24小时。收集培养基进行ISRE报告细胞活性分析。

图2B：用2'3'-cGAMP，A375 EXOs，2'3'-cGAMP和A375 EXOs，2'3'-cGAMP、A375 EXOs和STF-1623 ，或2'3'-cGAMP、A375 EXOs和ADP处理24小时后，对THP1-Lucia ISG细胞进行ISRE报告细胞活性分析。

图2C：2'3'-cGAMP 和不同浓度的A375 EXOs在STF-1623缺失或存在的情况下处理THP1-Lucia ISG细胞24小时的ISRE报告细胞活性分析。

图2D：不同浓度外泌体介导的STING信号的激活和抑制分析。

图2E：用2'3'-cGAMP，A549 EXOs ，2'3'-cGAMP和A549 EXOs，或2'3'-cGAMP、A549 EXOs和STF-1623 处理24小时的THP1-Lucia ISG细胞的ISRE报告细胞活性分析。并分别用MDA-MB-231 EXOs和SW480 EXOs进行实验。

图2F：用2'3'-cGAMP，A375 ENPP1-OE EXOs ，2'3'-cGAMPP和A375 ENPP1-OE EXOs，或2'3'-cGAMP、A375 ENPP1-OE EXOs和STF-1623处理24小时的THP1‐Lucia ISG细胞的ISRE报告细胞活性分析。并分别用A549 ENPP1-OE EXOs、MDA-MB-231 ENPP1-OE EXOs、SW480 ENPP1-OE EXOs进行实验。

        这些数据表明了肿瘤外泌体ENPP1通过水解2'3'-cGAMP抑制cGAS- STING通路的强大功能。

 

3.肿瘤外泌体ENPP1通过水解LL-37-2'3'-cGAMP抑制cGAS'-STING信号传导

图3A：用LL-37-2'3'-cGAMP，A375 EXOs，LL-37-2'3'-cGAMP和A375 EXOs，或LL-37-2'3'-cGAMP复合物、A375 EXOs和STF-1623 处理24h后THP1-Lucia ISG细胞的ISRE报告细胞活性分析。同时，用TAT作为对照试验。

图3B：在STF-1623不存在或不存在的情况下，用LL-37-2'3'-cGAMP和不同浓度的A375 EXOs处理THP1-Lucia ISG细胞24h, ISRE报告细胞活性分析。

图3C：用LL-37-2'3'-cGAMP处理THP1-Lucia ISG细胞，用LL-37-2'3'-cGAMP复合物和A375 EXOs处理STF-1623 ，或者用LL-37-2'3'-cGAMP复合物和A375 ENPP1-OE EXOs 处理STF-1623 处理24小时，并分别用A549 ENPP1-OE EXOs、MDA-MB-231 ENPP1-OE EXOs、SW480 ENPP1-OE EXOs进行实验。

图3D：标记Cy3的LL-37-2'3'-cGAMP、标记ENPP1-eGFP的A375 EXOs和标记Alexa Flour 647的CD9在THP-1细胞中的共定位分析。

        这些数据表明了肿瘤外泌体ENPP1在LL-37结合的2'3'-cGAMP水解抑制cGAS-STING信号通路中发挥重要作用。

 

4.肿瘤外泌体ENPP1水解细胞产生的内源性2'3'-cGAMP抑制旁邻细胞中的cGAS-STING信号

图4A：使用WT THP-1细胞产生2'3'-cGAMP和THP1-Lucia ISG细胞产生免疫应答的共培养系统示意图。WT THP-1细胞用HT-DNA 处理6小时，然后去除THP1-Lucia ISG细胞，在ENPP1蛋白或肿瘤来源的外泌体存在下，与加或不加STF-1623共培养48小时。收集不同时间的培养基进行ISRE报告活性分析。采用此方法将HT-DNA或CP-处理的人肿瘤细胞与THP1-Lucia ISG细胞共培养。

图4B-D：在ENPP1蛋白、A375 EXOs或A375 ENPP1-OE EXOs存在下，与HT-DNA处理过的WT THP-1细胞共培养48h的THP1-Lucia ISG细胞，ISRE报告细胞活性分析。

图4E：用2'3'-cGAMP ELISA试剂盒测定共培养24h细胞外2'3'-cGAMP的浓度。

图4F：THP1-Lucia ISG细胞与HT-DNA 共培养，在A375 EXOs、MDA-MB-231 EXOs 或A549 EXOs存在下，用加或不加STF-1623处理不同的ENPP1敲低肿瘤细胞48小时，ISRE报告细胞活性分析。

图4G：与CP共培养的THP1-Lucia ISG细胞，用加或不加STF-1623处理不同的人肿瘤细胞48小时，ISRE报告细胞活性分析。

图4H：肿瘤微环境中ENPP1介导的2'3'-cGAMP和LL-37-2'3'-cGAMP介导的cGAS-STING信号通路的机制模型。

         这些结果表明了肿瘤外泌体ENPP1介导的细胞外2'3'-cGAMP水解抑制了旁邻细胞中的cGAS-STING信号。

 

5.肿瘤外泌体ENPP1与人类癌症免疫抑制相关

图5A：Western blot分析从7例乳腺癌患者的癌旁组织和肿瘤组织纯化的外泌体中ENPP1、CD9的表达水平。

图5B：Western blot分析从6例肺癌患者的癌旁组织和肿瘤组织纯化的外泌体中ENPP1、CD9的表达水平。

图5C-D：在STF-1623 存在或不存在的情况下，乳腺肿瘤组织或肺肿瘤组织外泌体24小时后残留2'3'-cGAMP与初始2'3'-cGAMP的百分比。

图5E-F：人类乳腺癌组织和肺癌组织使用抗ENPP1，抗CD8或抗CD4抗体染色的代表性图像。

图5G-H：人乳腺癌源性外泌体ENPP1表达水平或肺癌源性外泌体ENPP1表达水平与单位面积CD8+ T细胞和CD4+ T细胞浸润数量的相关性分析。

        这些数据进一步表明了肿瘤外泌体ENPP1在癌症中的重要作用。

 

结论

        在本研究中，作者揭示了肿瘤外泌体ENPP1有效水解2'3'- cGAMP以抑制免疫细胞中cGAS-STING通路激活的新机制。作为内源性第二信使，2'3'-cGAMP在先天免疫应答中发挥重要作用。虽然先前的研究表明肿瘤细胞膜上的ENPP1蛋白可以通过水解2'3 '-cGAMP而损害免疫应答，但对依赖于其他形式的ENPP1蛋白影响STING激活的机制仍然知之甚少。本研究不仅发现来自各种肿瘤细胞的外泌体表达ENPP1蛋白，还发现ENPP1在外泌体上丰富富集。事实上，在测试的所有细胞类型中，观察到各种肿瘤来源的外泌体多可以有效地水解2'3'- cGAMP，这表明肿瘤外泌体ENPP1对2'3'- cGAMP的水解不是癌症特异性现象；还表明所有携带ENPP1的肿瘤来源外泌体可能具有水解2'3'-cGAMP的功能。这些外泌体表现出双重调节功能，不仅由于ENPP1的清除机制抑制免疫细胞的cGAS-STING信号通路激活，而且还协助2'3'-cGAMP增强免疫细胞的cGAS-STING信号通路。作者假设外泌体可能含有新的2'3'-cGAMP转运体。然而，外泌体的ENPP1抑制增强了免疫细胞的2'3'-cGAMP介导的STING信号反应。这些发现强调了肿瘤源性外泌体在cGAS-STING信号通路中的关键功能。