这“惊人的机缘”终于轮到了“BC来源的外泌体”！掌握这波神奇机制，震惊科研圈！毕竟突破一呈现，Nature子刊你就有！

癌细胞分泌包被生物活性物质的细胞外囊泡（EV），以促进体内器官间的交流，并且正在成为肿瘤进展和转移的关键介质，这种情况通常伴随着胆固醇代谢失调。EVs是否参与肿瘤转移过程中胆固醇稳态的控制尚不明确，需要进一步研究。

湾湾今天分享的是发表在【Nature COMMUNICATIONS】（IF：14.7）上题为“Tumor-derived miR-9-5p-loaded EVs regulate cholesterol homeostasis to promote breast cancer liver metastasis in mice”的研究，该研究发现乳腺癌来源的外泌体miR-9-5p通过靶向肝脏中的INSIG1、INSIG2和ATF3基因诱导HMGCR和CH25H的表达，这两种酶参与胆固醇合成和从胆固醇到25羟基胆固醇的转化。值得注意的是，体内miR-9-5p拮抗剂治疗和遗传性CH25H消融可阻止乳腺癌小鼠模型中的肿瘤转移。本研究结果揭示了肿瘤来源的miR-95p在肝转移中的调控机制，通过连接氧甾醇代谢和Kupffer细胞极化，为未来癌症诊断和治疗的应用提供了线索。

 

研究结果

1.乳腺癌源性EV增强肝脏胆固醇生物合成

图1a：移植MDA-MB-231/Lck-GFP细胞（231/Ctrl）或MDA-MB-231/Rab27a KD/Lck-GFP细胞（231/Rab27a KD）和无瘤小鼠肝脏中GFP信号的代表性图像。

图1b：对231/Ctrl小鼠和231/ Rab27a KD小鼠和无肿瘤小鼠的肝脏组织进行为期50天的RNA测序和GSEA，发现与指示通路相关的基因富集。

图1c：各组肝脏和血清总胆固醇（TC）。

图1d：肝组织切片的油红O染色图片。

图1e：胆固醇合成途径示意图。

图1f：qRT-PCR显示各组肝脏相对mRNA水平。

图1g：Western blot分析各组肝脏中与胆固醇合成相关的蛋白质。

图1h：肝组织切片中各组蛋白的免疫组化的代表性图像。

图1i：小鼠接受尾静脉注射Lck -GFP标记的EVs后肝脏中的GFP信号。

图1j：对静脉注射EVs 5周的小鼠和对照小鼠的肝组织进行RNA-seq及GSEA检测，发现与胆固醇生物合成途径相关的基因组富集。

图1k：各组肝脏总胆固醇（TC）变化。

图1l：左：尾静脉注射EVs 的NSG小鼠肝切片油红O染色。右：肝脏脂滴定量。

图1m：采用qRT-PCR分析接受指定EVs治疗的NSG小鼠胆固醇合成途径中多个标志物的基因表达。

图1n：Western blot分析接受MCF-10A和MDA-MB-231衍生EVs治疗5周的小鼠肝脏样本的蛋白表达。

图1o：以PBS为对照，用指定的EVs治疗原代肝细胞，Western blo分析与胆固醇合成相关的蛋白表达。

这些结果表明，乳腺癌来源的EVs在体外和体内都增强了胆固醇的生物合成。

 

2.循环miR-9-5p通过靶向INSIG1和INSIG2诱导胆固醇生物合成

图2a：MDA-MB-231 EVs和MCF-10A EVs中富集的miRNA与Targetscan数据库中针对胆固醇通路INSIG1和INSIG2的miRNA池重叠。

图2b：左：qRT - PCR测定了从正常和乳腺癌患者血清中提取的等量 EVs中的miR-9-5p水平。右：血清EVs的RNA质量。

图2c：qRT - PCR测定接受指示的荷瘤或无瘤小鼠肝脏和血清中miR-9-5p水平。

图2d：qRT - PCR检测接受尾静脉注射指定EVs的小鼠肝脏中miR-9-5p水平。

图2e：原位杂交检测无肿瘤、231/Ctrl和231/Rab27a KD小鼠肝脏中miR-9-5p。

图2f：预测miR-9-5p在人和小鼠INSIGS基因中的结合位点（分别为INSIG1和INSIG2）。图中显示了WT和突变报告基因中相应的序列。

图2g：荧光素酶报告基因检测显示报告基因在MCF-10A和MCF10A/miR-9细胞中对转染的人和小鼠INSIG1或INSIG2的反应性。

图2h：Western blot分析接受EVs注射小鼠肝脏样本。

图2i-j：小鼠肝脏和血清总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。

图2k：用qRT-PCR检测EVs /PBS处理48h后HL7702细胞的基因表达。

图2l：EVs /PBS处理48h后的HL7702细胞Western blot分析。

图2m：Western blot分析各组荷瘤小鼠肝脏样本。

图2n：根据相位图，在各组肝脏中分割LD区。

图2o：荷瘤小鼠肝脏和血清总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。

图2p：肝脏切片采用油红O染色。

这些结果表明，BC来源的miR-9-5p诱导HMGCR表达，通过靶向肝组织中的INSIG1和INSIG2促进胆固醇合成。

 

3.循环miR-9-5p通过靶向ATF3促进胆固醇向25-HC转化

图3a：对移植了MDA-MB-231细胞和231/miR-9 KO细胞的小鼠肝脏进行RNA-seq和GSEA检测，发现与胆固醇途径产生的氧甾醇相关的基因富集。

图3b：胆固醇转化为氧甾醇的示意图。

图3c：LC-MS/ MS分析异种移植NSG小鼠肝脏中胆固醇来源的氧甾醇。

图3d：经尾静脉注射EVs的小鼠肝脏中来源于胆固醇的氧甾醇的LC-MS/MS分析。

图3e：异种移植NSG小鼠肝脏中基因表达的qRT-PCR定量分析。

图3f：qRT-PCR定量分析尾静脉注射EVs后NSG小鼠肝脏基因表达。

图3g：预测人和小鼠ATF3基因中miR-9-5p的结合位点。图中显示了WT和突变报告基因中相应的序列。

图3h：野生型和突变型ATF3 3'UTR报告基因在MCF-10A和MCF-10A/miR-9细胞中对miR-95p的响应性。荧光素酶报告细胞试验显示报告细胞对转染野生型和突变型ATF3 3'UTR在MCF-10A和MCF-10A/miR-9细胞中的响应性。

图3i：miR9-5p mimic或对照转染MCF-10A细胞的qRT-PCR定量基因表达。

图3j：转染miR-9-5p mimic和对照组的MCF-10A细胞的Western blot分析。

图3k：用qRT-PCR方法定量EVs /PBS处理48h后原代肝细胞的基因表达。

图3l：EVs/PBS处理48小时后原代肝细胞的Western blot分析。

图3m：异种移植小鼠肝脏Western blot分析。

图3n：异种移植小鼠肝组织中ATF3和CH25H的免疫组化分析。

图3o：小鼠尾静脉注射EVs后肝脏Western blot分析。

图3p：经尾静脉注射EVs的小鼠肝组织中ATF3和CH25H的免疫组化分析。

这些结果表明，BC源性外泌体miR-9-5p诱导CH25H表达，通过靶向ATF3促进胆固醇转化为25-HC。

 

4.肿瘤代谢物25-HC促进BC肝和肺转移

图4a：观察异种移植小鼠的肿瘤体积。

图4b-c：各组接种小鼠的代表性生物发光图像及定量分析。

图4d-e：代表性IHC图像显示Ki67染色和Ki67+肿瘤细胞的总体百分比。

图4f：25-HC处理小鼠模型示意图。

图4g-h：各组接种小鼠的代表性生物发光图像及定量分析。

图4i：肝结节的定量。

图4j：ELISA检测各组肝脏25-HC水平。

 

5.阻断CH25H抑制BC肝和肺转移

图5a：CH25H肝脏条件敲除（CH25H^{L - / -}）和对照组（CH25H^fl/fl）小鼠血清25-HC的LC-MS/MS分析。

图5b：检测CH25H肝脏条件敲除（Ch25h^{L - / -}）和对照（Ch25h^fl/fl）小鼠总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。

图5c：异种移植E0771的Ch25h^{L - / -}和Ch25h^fl/f小鼠肝脏切片用油红O染色。

图5d：在CH25H肝脏特异性KO和WT小鼠中，使用¹⁸F-FDG进行具有代表性的PET/CT成像以获取肝脏和肺的摄取并定量。

图5e：各组接种小鼠肝、肺转移部位的代表性生物发光图像及定量。

图5f：具有代表性的免疫组图显示Ki67染色和Ki67+肿瘤细胞在指定组中的总体百分比。

图5g：各组肝脏CH25H的Western blot分析（上）；各组肝脏组织中IHC和CH25H的含量（下）。

图5h：各组接种小鼠肝、肺转移部位的代表性生物发光图像及定量。

图5i：具有代表性的免疫组图显示Ki67染色和指征组肝脏和肺部Ki67+肿瘤细胞的总体百分比。

图5j：用¹⁸F-FDG进行代表性PET/CT成像，以获取指示小鼠肝和肺的摄取和定量。

这些数据表明，25-HC促进了肝脏和肺转移，而敲除miR-9-5p或阻断CH25H表达完全消除了25-HC对肿瘤转移的影响。

 

6.25-HC通过提高MAFK水平诱导Kupffer细胞向M2型分化，促进肝转移

图6a：经25-HC和载体处理的RAW264.7细胞进行RNA-seq和GSEA检测，发现巨噬细胞通路相关基因组富集。

图6b：流式细胞术定量检测指定组纯化后表达CD11b+和F4/80+的Kupffer细胞。

图6c：各组肝、肺切片F4/80免疫组化分析。

图6d：各组肝、肺转移部位的代表性生物发光图像。

图6e：各组肝、肺切片Ki67免疫组化分析。

图6f：选择表达TIM4+、I-A/I-Eint的纯化Kupffer细胞，染色并进一步分析CD163和CD11c的表达的代表性的流式细胞术结果。

图6g：流式细胞术结果中M2/M1比值的定量。

图6h：qRT-PCR检测各组小鼠肝组织RNA水平。

图6i：热图显示了基于RNAseq数据的耐受巨噬细胞通路相关的选定基因的相对水平。

图6j：各小鼠肝脏中Mafk相对mRNA水平（上）；Western blot分析各组小鼠肝脏（下）。

图6k：25-HC剂量依赖性处理48 h后RAW264.7细胞中Mafk的qRT-PCR分析（上）；25-HC剂量依赖性处理48h后Raw264.7细胞的Western blot分析（下）。

图6l：采用小鼠趋化因子阵列试剂盒检测25-HC处理和对照raw264.7细胞培养基中各种趋化因子的不同表达和定量。

图6m：采用ELISA试剂盒检测载药和25-HC处理的BMDM细胞分泌的TGF-β和IL-10表达。

这些数据表明，25-HC诱导巨噬细胞向M2型极化，促进肺和肝转移。

 

7.外源性表达INSIGs和ATF3可阻断miR -9诱导的肿瘤转移

图7a：小鼠尾静脉注射AAV-GFP、AAV-ATF3和AAV-INSIG1 + INSIG2病毒后肝脏和肺部的GFP信号。

图7b:尾静脉注射AAV-GFP、AAVINSIG1和AAV-INSIG2病毒小鼠肝脏中基因表达的定量分析。

图7c：Western blot显示小鼠接受尾静脉注射AAV-GFP、AAV-INSIG1和AAV-INSIG2病毒后肝脏中与胆固醇合成相关的关键蛋白的表达。

图7d：AAV-GFP和AAV-INSIG1 + INSIG2组小鼠肝脏总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）。

图7e：Western blots显示接受尾静脉注射AAV-GFP和AAV-ATF3病毒的小鼠肝脏中蛋白表达。

图7f：代表性免疫组化图像显示CH25H染色。

图7g：AAV-GFP和AAV-ATF3组肝脏25-HC水平LC-MS/MS分析。

图7h：监测各组小鼠的体重。

图7i-j：各组小鼠的代表性生物发光图像及定量分析。

图7k：肝和肺转移结节的定量分析。

图7l：小鼠肝、肺组织中Mki67的RNA水平。

图7m：代表性IHC图像显示Ki67染色和Ki67+肿瘤细胞的总体百分比。

图7n：Western blots显示小鼠接受尾静脉注射AAV-GFP和AAV-ATF3病毒后肝脏中的蛋白表达。

图7o：AAV-GFP和AAV-ATF3组小鼠肝脏和肺部M1和M2标记基因RNA水平。

图7p：选择表达TIM4+、I-A/I-Eint的纯化Kupffer细胞，染色并进一步分析CD163和CD11c的表达。显示了代表性的流式细胞术结果。

图7q：流式细胞术结果中M2/M1比值的定量。

这些数据表明，miR-9-5p介导的胆固醇稳态调节的显著恢复。

 

8.miR-9-5p沉默减弱了25-HC介导的肿瘤转移

图8a：antagomir处理小鼠模型示意图。

图8b：RT-QPCR检测经antagomir和231/Ctrl、231/Rab27a KD和231/miR-9 KO处理的231/Luc细胞异种移植小鼠血清、肿瘤、肝脏和肺部miR-9-5p水平。

图8c：使用18F-FDG进行代表性PET/CT成像，以获取经antagomir处理的4T1/Luc细胞异种移植小鼠的肝和肺摄取和定量。

图8d：antagomir和231/Ctrl、231/Rab27a KD和231/miR-9 KO处理的异种移植小鼠肝脏和肺转移部位的代表性生物发光图像。

图8e：用antagomir和231/Ctrl、231/Rab27a KD和231/miR-9 KO处理的异种移植小鼠的肝和肺转移的定量。

图8f：用antagomir和231/Ctrl、231/Rab27a KD和231/miR-9 KO处理的异种移植小鼠肝脏中基因表达的定量。

图8g：异种移植小鼠肝脏基因表达的定量分析。

图8h：Western blot分析使用antagomir和231/Ctrl、231/ Rab27a KD和231/miR-9 KO处理的异种移植小鼠的肝脏样本。

这些数据表明，miR-9-5p的沉默通过改变巨噬细胞极化减弱了25-HC介导的肿瘤转移，表明靶向循环miR9-5p和25-HC生物合成的潜在治疗应用。

 

9.循环miR-9-5p与BC患者转移相关

图9a：RT-QPCR测定来自各细胞的等量EVs中的miR-9-5p水平。

图9b：RT-QPCR检测异种移植小鼠血清中miR-9-5p水平。

图9c：乳腺癌患者肝转移灶miRNA原位杂交（miRNA- ish）的代表性图像。

图9d：rt - qpcr检测正常或有无转移的BC患者血清中miR-9-5p水平。

图9e：TCGA数据库中BRCA肿瘤样本中miR-9-5p的表达水平。

图9f：GEO数据库中BRCA肿瘤样本miR - 9-5p的表达水平。

图9g：miR-9-5p在不同分期BRCA肿瘤样本中的表达水平。

图9h：HMGCR、CH25H、INSIG1、INSIG2和ATF3在BC和非BC个体肝转移中的表达的免疫组化分析。

图9i：LC-MS/MS分析正常和BC患者血清中来源于胆固醇的氧甾醇。

图9j：BC转移性肝患者MRC1与Ki67表达的相关性分析。

这些数据表明，循环中的miR-9-5p调节胆固醇稳态和25-羟基胆固醇作为肿瘤代谢物通过调节肝脏中的Kupffer细胞极化诱导BC转移。

 

总结

该研究揭示了利用miR-9-5p作为一种新的基于血液的生物标志物来识别BC转移高风险患者的可能性，以指导预防性筛查和早期干预。考虑到CH25H在我们的模型中是调节肿瘤转移的关键酶，靶向其表达或阻断其活性可能是一种有效的临床应用策略。靶向蛋白水解嵌合体（PROTAC）正在成为一种新兴的治疗方式，具有治疗致病蛋白的潜力，这些蛋白在历史上一直是传统小分子靶向治疗的高度挑战。因此，PROTACs靶向CH25H的研究将是下游临床应用治疗癌症的有力策略。