解析Wnt信号肽，推动外泌体研究飞跃！IF：11.7优质佳作，还等什么？赶紧上车！

有研究表明，外泌体EVs表面分泌不同的Wnt蛋白，并且EVs-Wnt完全能够在靶细胞中引发适当的信号传导，虽然EVs对于长距离Wnt信号传导发挥着重要作用，但Wnt如何与这些迁移细胞器连接仍未可知。

湾湾今天分享的是一篇发表在【SCIENCE ADVANCES】（IF：11.7）上题为“Identification of the Wnt signal peptide that directs secretion on extracellular vesicles”的研究，研究发现Wnt7a在肌肉损伤后在细胞外囊泡（EVs）表面长距离分泌。且在Wnt中定义了EVs分泌所需的信号肽区域，称为外泌体结合肽（EBP）。将EBP添加到一种不相关的蛋白中，直接在EVs上分泌。Wnt7a-EV的分泌不需要棕榈酰化和信号肽。Coatomer被鉴定为EBP的EVs结合蛋白。对共晶结构、结合热力学和诱变的分析发现，一个双赖氨酸基序介导EBP与涂层的结合，在Wnt家族中具有保守功能。作者发现EBP是Wnt7a再生过程中体内表达生物活性所必需的。总的来说，该研究已经阐明了Wnt在EVs分泌的结构基础和独特性，替代规范分泌，为创新的治疗靶向策略和全身蛋白质递送开辟了道路。

 

研究成果

1.肌肉损伤后Wnt7a在EVs上分泌

图1肌肉损伤会触发EVs表面Wnt7a的分泌。

图1A：野生型(WT)小鼠心脏毒素 (CTX)损伤后96小时，新再生肌纤维的抗Wnt7a标记的免疫金电子透射显微镜 (iTEM)显示多泡体（MVBs）中包含的腔内囊泡上有Wnt7a分泌。

图1B：纯化野生型（WT）小鼠受损胫骨前肌（TA）肌肉的抗Wnt7a标记的iTEM显示，浸润在新再生肌纤维周围受损组织的EVs上存在Wnt7a。

图1C：对来自肌肉的EVs部分进行免疫印迹分析，显示Wnt7a表达。

图1D：用于在表达Myf5的细胞中产生条件Wnt7a floxed的小鼠品系的示意图。

图1E：Myf5 (Cre/+)中 Wnt7a 表达消除的免疫荧光证实： CTX 损伤后 96 小时， Wnt7a (fl/fl)损伤 TA。

图1F：EV 的抗 Wnt7a 标记的 iTEM，显示来自Myf5 (Cre/+) : Wnt7a (fl/fl)小鼠肌肉外植体的 EV 中 Wnt7a 表达的消除。比例尺，100 nm。

图1G：从 Myf5 (Cre/+)分离的EVs中Wnt7a表达废除的免疫印迹验证：CTX损伤后96小时的Wnt7a (fl/fl)后肢肌肉。

图1H：含有Wnt7a的肌肉EVs刺激后肥大肌管的泛肌球蛋白重链免疫荧光代表性图像。

图1I ：用来自肌肉的EV处理的小鼠原代肌管的肥大测定减少了Wnt7a缺失后的肥大。

这些数据表明，肌肉损伤后分泌在EVs上的Wnt7a在体内的再生肌肉反应中有积极的作用。

 

2. EVs上的Wnt7a分泌受内部序列调节

图2 EVs上的Wnt7a分泌受到内部肽序列的调节。

图2A：免疫印迹分析显示，在位置100氨基酸删除后，EVs分泌中断，但在位置300之后则不会。

图2B：免疫印迹分析显示，Wnt7a的内部100至300个氨基酸序列足以进行EVs分泌。

图2C：Wnt7a的Δ G FoldX表明Δ1-49和Δ301-349不影响折叠并且功能不会丢失。Δ1–212 影响蛋白质折叠。Δ251-349不影响折叠，但功能会丢失，因为EBP的一个区域被截断。

图2D：Wnt7a的表面，带负电的残基为红色，带正电的残基为蓝色，疏水性残基为绿色； 外泌体结合肽（EBP）带正电。

图2E：免疫印迹分析表明，用连接结构域GSGS连接子替换EBP会消除EVs分泌，有利于非EVs Wnt7a 分泌。

图2F：在有和没有EBP的情况下对EVs和非EVs蛋白片段上的Wnt7a表达进行定量。

综上结果表明EVs上的Wnt7a分泌受内部序列调节。

 

3. EBP足以为EVs提供靶向性

图3 EBP足以为EVs提供靶向性

图3A：通过将EBP插入EVs上不分泌的 Wnt7a截短片段的上游结构域来恢复EVs分泌。图3B：C端连接的EBP但N端连接的EBP将 Wnt7a-Δ213-249 靶向至EVs。

图3C：EBP HALO荧光标记蛋白的连接导致EVs分泌。

图3D：EVs的iTEM图像，具有抗HALO免疫染色，显示EVs表面上HALO*EBP的表达。

图3E：用HALO*EBP EVs处理后，与源自用不同Wnt7a-HA和HALO标记截短体转染的 HEK293T细胞衍生的HALO EVs处理后，通过HEK293T细胞内的荧光检测HALO。

以上结果表明EBP足以介导蛋白质靶向到EVs，然后递送到受体细胞。

 

4. Wnt7a-EVs的分泌不需要SP或棕榈酰化，Wnt7a结合外膜蛋白

图4 Wnt7a在EVs上的分泌不依赖于经典途径，需要EBP的EVs结合蛋白（Coatomer）。

图4A：转染的人胚胎肾 HEK293T细胞中的EVs-Wnt7a分泌不需要N末端信号肽SP。

图4B：缺乏棕榈酰化位点的突变体Wnt7a_S206A在转染的HEK293T细胞的EVs上分泌。 图4C：化学抑制剂PORCN的药物抑制不影响EVs上Wnt7a的分泌。

图4D：siRNA 中WLS的敲低部分影响EVs上Wnt7a的分泌，但消除了非EVs Wnt7a 的分泌。

图4E：用于BioID分析的生物素连接酶BirA构建体。

图4F：热图显示质谱中富集蛋白质的倍数变化。

图4G：Wnt7a：COPA PLA（红色）在表达Wnt7a-BirA或BirA的小鼠原代肌管中进行。

图4H：Wnt7a：COPA PLA（橙色）在RPTEC-hTERT1细胞中进行。

图4I：Wnt7a分泌于源自RPTEC-hTERT1细胞的EVs上。

图4J：Wnt7a：COPA PLA（红色）在表达Wnt7a-FL、Wnt7a_ΔEBP*GSGS或Wnt7a_ΔSP的 HEK293T细胞中进行。

图4K-L：Wnt7a -血凝素（HA）与COPA和COPB2相互作用，用COPB2抗体免疫沉淀过表达Wnt7a-HA的HEK293T细胞或用HA抗体免疫沉淀。

图4M：siRNA敲低COPA和COPB2后Wnt7a的免疫印迹EVs分泌分析显示转染的 HEK293T细胞中Wnt7a-EVs分泌受到破坏。

综上，图4A-D的结果表明Wnt7a-EVs的分泌不需要SP或棕榈酰化；Wnt7a通过与外膜蛋白相互作用而被转运到EVs的另一种分泌机制（图4E-M）。

 

5. KxK基序介导外泌体结合肽（EBP）与外涂剂的结合

图5 Wnt7a结合Coatomer蛋白。

图5A：AlphaFold中预测的Wnt7a 结构（蓝色），其中EBP区域以橙色突出显示，以及EBP 内的三个带正电荷的基序（红色）。

图5B：Wnt7a-ESP*Scramble突变体保留了二赖氨酸基序并且对EVs分泌没有表现出损害。 图5C：等温滴定量热法（ITC）测量COPB2 1-304与EBP内潜在的二赖氨酸/精氨酸基序的结合。WT COPB2 1-304与LKIKKP亚区结合。

图5D：COPB 1-304 WD重复结构域的顶视图（绿色）与带状表示中的LKIKKP肽（橙色）。 图5E：LKIKKP肽的特写视图，具有通过省略肽计算的差异电子密度图，并在3σ处绘制轮廓（蓝色网格）。

图5F：具有氢键和距离的结合基序的侧视图。

图5G：基于结构的点突变证实ITC检测中KxKx基序的分子识别。

图5H：丙氨酸对K253和K255的双赖氨酸突变破坏了Wnt7a-EVs的分泌。

图5I：用包含KR和RR基序的Wnt10a-EBP或Wnt16 EBP替换Wnt7a-EBP（右）。用 Wnt10a-EBP或Wnt16 EBP替换可以挽救Wnt7a-EVs的分泌。

图5J：EBP去除或EBP内双精氨酸突变后Wnt10b的EVs分泌分析（右）。双精氨酸突变会破坏EVs上Wnt10b的分泌，其程度与去除整个Wnt10b EBP序列相同。

图5K：EBP去除或EBP内整个带正电基序RPR、KHR和KH突变后Wnt3a的分泌分析（右）。只有RPR和KHR基序的同时突变才会破坏EVs上Wnt3a的分泌，其程度与去除整个Wnt3a EBP序列相同。

这些结果表明，外膜蛋白通过EBP结构域内的正电荷基序与Wnt家族成员直接结合。

 

6. Wnt7a与Coatomer的相互作用是肌肉再生反应所必需的

图6 Wnt7a与Coatomer的相互作用是肌肉再生反应所必需的。

图6A：使用siRNA敲低COPA和COPB2会破坏稳定表达Wnt7a的原代成肌细胞中的 Wnt7a-EVs分泌。

图6B：COPA和COPB2的敲低减少了Wnt7a转染的肌管的肥大。相反，敲低并不影响不表达Wnt7a的肌管的肥大。

图6C：肌管中COPA和COPB2同时siRNA敲低后的代表性图像。

图6D：体内工作流程的示意图。

图6E：比较用Wnt7a（绿色）与Wnt7a_ΔEBP*GSGS（灰色）电穿孔的TA的肌纤维口径分布。

图6F：比较用Wnt7a（绿色）与Wnt7a_ΔEBP*GSGS（灰色）电穿孔的TA的平均最小纤维细度。

图6G：比较用Wnt7a（绿色）与Wnt7a_ΔEBP*GSGS（灰色）电穿孔的TA的纤维数量量化。

图6H：比较用Wnt7a（绿色）与Wnt7a_ΔEBP*GSGS（灰色）电穿孔的TA的肌肉面积定量。

图6I：TA肌肉切片显示，将Wnt7a_ΔEBP*GSGS电穿孔至MDX的TA肌肉后，肌纤维口径减小，肌纤维数量增加。

这些数据表明Wnt7a在肌肉再生过程中的分泌是体内Wnt7a生物活性所必需的。

 

结论

该研究发现Coatomer成分在EVs急性损伤时分泌Wnt的额外作用。研究已经阐明了Wnt7a与Coatomer结合并在EVs外表面分泌的结构基础。该已经确定了Wnt-Coatomer相互作用的序列要求，并表明EVs分泌多种Wnt的机制类似。此外，研究实验表明，在肌肉再生过程中，体内Wnt7a的生理分泌是由EVs介导的，这阐明了Wnt在体内长距离信号传递的能力。

本研究实验表明，装载在EVs上的Wnt7a全身递送代表了治疗神经肌肉疾病的潜在疗法。利用EBP来指导货物蛋白在EVs表面的呈现，为多种治疗应用打开了大门。该研究的结果将成为更复杂的递送系统的起点，能够为理解病理背景下的Wnt分泌提供重要的见解。