植物来源“外泌体”爆7+大招！组装“外泌体”如何大显身手，彰显自身特长？一文带你走近外泌体创新！

乳腺癌是全球女性中第二大致命癌症，现有治疗手段存在诸多局限性，如手术可能导致肿瘤细胞扩散、化疗药物存在靶向性差和耐药性等问题。人参来源的外泌体样纳米颗粒（GENs）因具有高递送效率、高生物利用度和肿瘤靶向性等优势，在肿瘤治疗方面展现出潜力，但GENs在体内易被快速清除，稳定性和在肿瘤组织中的滞留性差。

 

湾湾今天分享的是一篇发表在【Int J Biol Macromol】（IF：7.7）上题为“Enhanced therapeutic effects of ginseng-derived exosome-like nanoparticles loaded hyaluronic acid injectable hydrogels for breast tumor treatment”的研究，该研究制备了基于改性透明质酸（HA）和羧甲基壳聚糖（CMCS）的水凝胶，并将人参来源的外泌体样纳米颗粒（GENs）负载其中，旨在提高GENs的稳定性和在肿瘤组织中的滞留性，进而增强其肿瘤治疗效果。

 

研究成果

1.GENs的提取、纯化和鉴定

图1A：从新鲜人参中分离GENs的过程示意图，包括高速剪切、多次离心和过滤等步骤。

图1B：超速离心后的蔗糖梯度中的变化。结果显示GENs在蔗糖梯度中的分布主要集中在30%-45%的界面处。

 

 

图2A：通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定的GENs颗粒计数。结果显示其粒径均匀分布在150 nm左右，无杂峰。

图2B：透射电镜（TEM）成像。结果显示GENs呈碟状形态，形状均匀，无聚集或降解现象。

图2C：GENs的尺寸测定。结果显示平均粒径为146.2 nm。

图2D：GENs的zeta电位测定。结果显示为-18.7±1.4 mV。

图2E：原子力显微镜（AFM）成像。结果显示GENs表面纳米颗粒均匀分布，表面相对平坦。

图2F：通过BCA试剂盒测定GENs蛋白质浓度。结果显示蛋白质浓度为1.53±0.34 mg/mL。

图2G：通过HPLC分析GENs中人参皂苷的浓度。HPLC分析结果显示主要含磷脂酰胆碱、甘油三酯、神经酰胺等脂质以及多种人参皂苷。

图2H：GENs的脂质组学分析图表。结果显示其主要由磷脂酰胆碱（30.0%）、甘油三酯（18.5%）、神经酰胺（15.0%）组成。

这些结果表明，成功从人参中分离出GENs，其粒径均一、形态光滑，且含有多种生物活性成分，具备潜在的抗肿瘤物质基础。

 

2. GENs稳定性研究

 

图3A：在30天内对GENs粒径稳定性进行测量。结果显示在-80℃和-20℃下，GENs粒径30天保持稳定（150nm），4℃下20天内稳定，20天后出现条纹沉淀。

图3B：在30天内对GENs电位稳定性进行测量。结果显示在-80℃和-20℃下，GENs电位30天保持稳定（-20mV），4℃下20天内稳定，之后电位随温度升高略有增加。

这些结果表明，GENs在-80℃和-20℃下稳定性良好，4℃下稳定性会随时间下降，温度对其稳定性有影响。

 

3. GENs@Hydrogels水凝胶的制备与表征

 

图4A：扫描电镜（SEM）观察水凝胶（Hydrogels）和GENs@Hydrogels的微观结构。结果显示二者均具有规则均匀的多孔网状结构，GENs@Hydrogels含有丰富的GENs包埋物。

图4B：通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）对CMCS、HA、OHA、Hydrogels和GENs@Hydrogels的化学结构进行表征。结果显示GENs间存在氢键。

图4C：OHA和CMCS混合溶液的凝胶行为研究。结果显示二者混合后具有理想的原位凝胶形成性能。

图4D：测量凝胶前体溶液的粘度变化和凝胶化时间。结果显示GENs@Hydrogels的凝胶化时间与空白水凝胶相似，且凝胶化速率更快。

图4E-F：通过动态剪切振荡测量在小应变下Hydrogels和GENs@Hydrogels的储能模量。结果显示存储/损耗模量比略有下降。

这些结果表明，成功制备了具有特定结构和性能的GENs@Hydrogels，其具备良好的凝胶形成能力和稳定性，且对酸性环境有响应性。

 

4.体外生物相容性分析及GENs@Hydrogels中GENs的体外释放研究

图5A：各实验组的溶血率评估。结果显示，CMCS、OHA、GENs、GENs@Hydrogels均具有良好的生物相容性。

图5B：用GENs@Hydrogels处理MCF-10A细胞后的细胞活力检测。结果显示当GENs@Hydrogels浓度在2-64 μg/mL时，细胞活力均高于90%。

图5C：GENs在有无水凝胶情况下的体外累积释放曲线。结果显示在PBS中，GENs在24h内释放超过90%，而GENs@Hydrogels具有持续释放性能，72h内释放约50%。

图5D：在不同pH条件下GENs从GENs@Hydrogels中的释放情况。结果显示在pH为5时，72h内释放显著增强，达到约74%；pH为6.8时，72h内释放约58%。

这些结果表明，Hydrogels和GENs具有良好的生物相容性和低细胞毒性，GENs@Hydrogels具有酸敏感释放和控释特性。

 

5.体外细胞摄取和溶酶体定位研究

 

图6A：通过荧光显微镜观察4T1细胞对GENs和GENs@Hydrogels的摄取情况。结果显示随着时间推移，细胞对GENs的摄取呈时间依赖性增加，培养4h后，处理组细胞出现明显红色荧光，且游离GENs的细胞摄取高于GENs@Hydrogels。

图6B：处理6h后，4T1细胞中GENs和GENs@Hydrogels的溶酶体定位研究。结果显示细胞内药物（红色荧光）增加，表明GENs能成功从溶酶体逃逸。

这些结果表明，4T1细胞能够摄取GENs和GENs@Hydrogels，且GENs可从溶酶体逃逸，有利于发挥其抗肿瘤作用。

 

6. GENs和GENs@Hydrogels的体外抗肿瘤作用

 

图7A：MTT法检测GENs和GENs@Hydrogels对4T1细胞的细胞毒性活性。结果显示在不同浓度下GENs组和GENs@Hydrogels组细胞活力随浓度变化，且GENs@Hydrogels组细胞活力下降更明显。

图7B：计算GENs和GENs@Hydrogels对4T1细胞的半数抑制浓度。结果显示GENs和GENs@Hydrogels对4T1细胞的半数抑制浓度分别为21.76 μg/mL和11.16 μg/mL。

图7C-D：克隆形成实验检测GENs和GENs@Hydrogels对4T1细胞增殖的抑制能力。结果显示二者均能抑制4T1细胞增殖，GENs@Hydrogels的抑制作用更强。

图7E-F：通过流式细胞术评估GENs和GENs@Hydrogels处理4T1细胞4h后的凋亡率。结果显示凋亡率增加。

这些结果表明，GENs和GENs@Hydrogels对4T1细胞具有明显抑制作用，GENs@Hydrogels能增强GENs的细胞毒性，促进肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖。

 

7. GENs/GENs@Hydrogels的体外抗肿瘤机制研究

 

图8A：用JC-1染色检测4T1细胞线粒体膜电位变化。结果显示对照组JC-1无明显凋亡诱导作用，GENs和GENs@Hydrogels处理组线粒体膜电位下降。

图8B：检测4T1细胞中PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR、p-m-TOR的表达。结果显示GENs和GENs@Hydrogels处理后，PTEN水平显著增加，p-PI3K、p-AKT和p-mTOR表达显著下降，p-PI3K/PI3K、p-Akt/AKT和p-mTOR/mTOR比值显著降低。

图8C：检测4T1细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达。结果显示GENs和GENs@Hydrogels处理后，Bax、Caspase-3、Caspase-9显著上调，Bcl-2显著下调。

图8D：检测4T1细胞中PD-L1的表达。结果显示GENs和GENs@Hydrogels处理后，PD-L1表达显著下调。

这些结果表明，PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路和caspase依赖通路与GENs和GENs@Hydrogels诱导的4T1细胞死亡相关，且二者可能通过免疫调节发挥体内抗肿瘤作用。

 

8.体内抗肿瘤疗效研究

 

图9A：体内抗肿瘤实验设计，建立小鼠4T1皮下肿瘤模型，分组并进行不同处理。

图9B：体内荧光成像。结果显示水凝胶提高了GENs在肿瘤部位的滞留。

图9C：监测肿瘤体积变化。结果显示GENs组和GENs@Hydrogels组均能抑制肿瘤生长，高剂量组效果更显著，且GENs@Hydrogels组抑制效果优于GENs组。

图9D：记录4T1荷瘤小鼠体重。结果显示处理后小鼠体重稳定，表明GENs和GENs@Hydrogels无明显副作用。

图9E：统计4T1荷瘤小鼠生存时间。结果显示GENs组和GENs@Hydrogels组生存时间延长。

图9F：测量4T1荷瘤小鼠肿瘤重量变化。结果显示肿瘤重量变化与肿瘤体积变化趋势一致。

图9G：肿瘤组织的H&E和TUNEL染色结果。结果显示GENs和GENs@Hydrogels组肿瘤细胞显著减少，GENs@Hydrogels高剂量组肿瘤抑制最强，且该组肿瘤细胞凋亡率高于GENs组。

这些结果表明，GENs和GENs@Hydrogels在体内均具有抗肿瘤效果，GENs@Hydrogels通过增强GENs的滞留和稳定性，抗肿瘤效果更优，且无明显副作用。

 

9. GENs和GENs@Hydrogels的免疫调节作用研究

 

图10A-C：检测不同组肿瘤浸润的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞百分比。结果显示GENs和GENs@Hydrogels处理后，CD8⁺T细胞（细胞毒性T细胞）显著增加，CD4⁺T细胞（辅助性T细胞）略有下降。

图10D：检测肿瘤中MHC-I水平。结果显示GENs和GENs@Hydrogels处理后，MHC-I水平显著上调。

图10E：检测不同组肿瘤浸润的调节性T细胞（Tregs，FoxP3⁺和CD25⁺）百分比。结果显示GENs和GENs@Hydrogels处理后，Tregs水平显著下降，且各处理组CD8⁺/Treg和CD8⁺/CD4⁺比值高于对照组。

 

 

图11A：肿瘤组织的PD-L1抗体染色。结果显示GENs和GENs@Hydrogels处理后PD-L1表达下降。

图11B-C：定量分析肿瘤中PD-L1的表达。结果显示PD-L1的表达下降。

图11D：用Texas Red标记GENs后注射，观察荧光信号。结果进一步证实水凝胶可提高免疫调节能力和肿瘤抑制效果。

这些结果表明，GENs和GENs@Hydrogels通过调节T细胞、PD-L1和MHC-I发挥免疫调节作用，有利于增强全身抗肿瘤T细胞免疫，抑制肿瘤生长，且GENs@Hydrogels组治疗效果更好（图10）；且GENs和GENs@Hydrogels可下调肿瘤中PD-L1表达，水凝胶通过增加GENs在肿瘤部位的滞留和肿瘤细胞对药物的摄取，提升免疫调节和肿瘤抑制效果（图11）。

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10.器官的组织病理学结果

 

图12：主要脏器HE染色。结果未发现明显损伤。结果表明 GENs 和 GENs@Hydrogels 具有良好的生物相容性。

 

结论

该研究成功开发了负载GENs的可注射水凝胶，GENs@Hydrogels通过调节细胞增殖和肿瘤微环境，显著抑制肿瘤生长。水凝胶能将外泌体保留在肿瘤部位并持续释放GENs，维持其稳定性，增强治疗效果。该系统是一种有前景的治疗策略，未来可探索更多给药通路和联合治疗方案，以适应不同类型肿瘤的治疗需求。