IF40 +顶刊手把手教学：如何用外泌体 + 焦亡机制发高分？这篇文献堪称“教科书”！

阿霉素（DOX）是乳腺癌治疗的核心化疗药物，但其诱导的心脏毒性（DOXIC）严重限制临床应用。

 

湾湾今天分享的是发表在【Signal Transduct Target Ther】（IF：40.8）上题为“Exosomal transfer of pro-pyroptotic miR-216a-5p exacerbates anthracycline cardiotoxicity through breast cancer-heart pathological crosstalk”的研究。该研究聚焦于肿瘤与心脏的跨器官病理通信机制，发现乳腺癌细胞通过外泌体（EXOs）传递促焦亡的微小RNA（miR-216a-5p），激活心肌细胞焦亡通路，为缓解DOXIC提供了新靶点。研究通过体外共培养模型、外泌体功能验证及体内动物实验，系统揭示了“乳腺癌-心脏”病理串扰的分子机制。

 

研究结果

1、与乳腺癌细胞共培养加重DOX诱导的心肌细胞焦亡

图1a：Transwell共培养系统示意图，显示乳腺癌细胞（BCCs）与心肌细胞（AMVCs/hiPSC-CMs）通过外泌体传递信号的上下层培养设计。

图1b-e：与BCCs共培养的心肌细胞在DOX处理后，细胞活力显著降低，乳酸脱氢酶（LDH）释放量和促炎因子IL-18水平显著升高，提示细胞损伤加重。

图1f-g：共培养的心肌细胞出现典型焦亡形态（气泡状突起、细胞肿胀），免疫荧光显示ASC斑点形成（焦亡标志物），证实焦亡通路激活。

图1h-i：抑制外泌体释放（GW4869）可显著减弱焦亡相关蛋白（GSDMD-N、CleavedCASP1、CleavedIL-1β）表达及IL-18分泌，而促进外泌体释放（Monensin）则加剧损伤。

这些结果表明，乳腺癌细胞通过外泌体传递信号，显著加剧DOX诱导的心肌细胞焦亡。

 

2、外泌体来自DOX诱导的乳腺癌细胞（D-BCC-EXOs）加重心肌细胞焦亡

图2a：透射电镜显示D-BCC-EXOs呈典型杯状膜结构，粒径约100-200nm，符合外泌体形态特征。

图2b：纳米追踪分析（NTA）显示，DOX刺激后乳腺癌细胞释放的外泌体浓度显著增加，粒径分布集中在100-200nm。

图2c：Western blot证实D-BCC-EXOs表达外泌体特异性标志物（CD81、TSG101、HSP70），不表达细胞内蛋白（GM130、Calnexin），验证其纯度。

图2d：荧光标记实验显示，D-BCC-EXOs被心肌细胞高效摄取，且摄取效率显著高于正常乳腺癌细胞外泌体（N-BCC-EXOs）。

图2e-n：D-BCC-EXOs处理显著降低心肌细胞活力，增加LDH释放量，并上调焦亡相关蛋白（CleavedCASP1、GSDMD-N、IL-1β）及细胞因子（IL-18）表达，而N-BCC-EXOs无此效应。

这些结果表明，DOX诱导的乳腺癌细胞外泌体（D-BCC-EXOs）被心肌细胞摄取后，直接诱导焦亡并加重DOXIC。

 

3、D-BCC-EXOs在体内加重DOX诱导的心肌损伤和焦亡

图3a：小鼠尾静脉注射D-BCC-EXOs的体内实验设计示意图，构建DOXIC小鼠模型。

图3b-f：超声心动图显示，D-BCC-EXOs加剧DOX诱导的左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）下降，以及舒张功能异常（E/A和E/E’比值降低），提示心功能恶化。

图3g-j：组织染色显示，D-BCC-EXOs增强DOX诱导的心肌空泡化（HE染色）、纤维化（Sirius红染色）及心肌细胞萎缩（WGA染色）。

图3k-o：Western blot证实，D-BCC-EXOs显著上调心肌组织中焦亡相关蛋白（GSDMD-N、CleavedCASP1、CleavedIL-1β）表达。

这些体内实验证实，乳腺癌来源外泌体通过循环系统传递，加剧DOX诱导的心肌结构损伤和焦亡。

 

4、miR-216a-5p是D-BCC-EXOs加重DOXIC的关键效应分子

图4a：外泌体miRNA测序火山图显示，DOX处理后乳腺癌细胞外泌体中14个miRNA显著上调，其中miR-216a-5p上调最显著。

图4b-c：qRT-PCR验证，miR-216a-5p在D-BCC-EXOs中表达水平显著高于N-BCC-EXOs；其模拟物转染心肌细胞后，细胞活力显著降低，提示促损伤作用。

图4d：Venn分析显示，miR-216a-5p是唯yi同时满足“测序上调”和“功能验证损伤”的miRNA。

图4e-j：功能获得/缺失实验表明，miR-216a-5p mimic加重DOX诱导的心肌细胞死亡和LDH释放，而抑制剂则显著减轻损伤。

图4k-n：Western blot显示，miR-216a-5p上调焦亡相关蛋白（NLRP3、GSDMD-N、CleavedCASP1）表达，激活焦亡通路。

这些结果表明，miR-216a-5p是D-BCC-EXOs的核心致病因子，通过诱导心肌细胞焦亡加重DOXIC。

 

5、DOX通过ATF3上调miR-216a-5p转录

图5a：qRT-PCR显示，DOX处理的乳腺癌细胞和肿瘤组织中，miR-216a-5p前体（pri-miR-216a）表达显著增加，提示转录水平激活。

图5b-c：ATF3siRNA敲低后，pri-miR-216a表达显著下降；ATF3过表达则显著上调其表达，表明ATF3调控miR-216a-5p转录。

图5d-e：荧光素酶报告实验证实，ATF3直接结合miR-216a启动子区域，且DOX处理显著增强该结合作用。

图5f：染色质免疫沉淀（ChIP）实验验证，ATF3与miR-216a启动子存在直接结合，DOX处理后结合强度显著增加。

图5g：时间依赖性实验显示，ATF3与miR-216a-5p表达呈正相关（r=0.7334），证实DOX通过ATF3上调miR-216a-5p。

图5h：CCK-8实验显示，ATF3敲低的乳腺癌细胞来源外泌体（siATF3-BCC-EXOs）处理后，心肌细胞活力显著高于对照组（siNC-BCC-EXOs），表明ATF3缺失减弱外泌体的心肌损伤作用。

图5i-j：LDH释放实验和ELISA显示，siATF3-BCC-EXOs组心肌细胞LDH释放量、IL-1β和IL-18水平显著低于siNC-BCC-EXOs组，证实ATF3敲低抑制外泌体诱导的焦亡。

图5k：Westernblot显示，siATF3-BCC-EXOs处理的心肌细胞中焦亡相关蛋白（GSDMD-N、CleavedCASP1）表达显著下调。

这些结果表明，DOX通过激活ATF3转录因子，促进乳腺癌细胞中miR-216a-5p的转录和表达。ATF3通过调控miR-216a-5p的转录和外泌体传递，介导乳腺癌细胞与心肌细胞之间的病理串扰，敲低ATF3可减轻外泌体诱导的心肌焦亡。

 

6、SF3B4选择性包装miR-216a-5p进入外泌体

图6a：生物信息学预测显示，RNA结合蛋白SF3B4是miR-216a-5p的潜在结合蛋白，其结合基序为“CUGUGA”。

图6b-c：SF3B4siRNA敲低后，外泌体中miR-216a-5p水平显著下降，但乳腺癌细胞内miR-216a-5p水平不变，提示SF3B4调控外泌体包装过程。

图6d-e：RNA pulldown实验证实，SF3B4与miR-216a-5p直接结合，突变miR-216a-5p的“CUGUGA”基序后，结合作用消失。

图6f：电泳迁移率实验（EMSA）显示，野生型miR-216a-5p与SF3B4结合，突变型不结合，验证结合特异性。

图6g-k：SF3B4敲低减少外泌体传递至心肌细胞的Cy3-miR-216a-5p荧光信号，并显著减弱心肌细胞损伤和焦亡标志物表达。

这些结果表明，SF3B4通过特异性结合miR-216a-5p，将其选择性包装入乳腺癌细胞外泌体，促进心肌损伤信号传递。

 

7、miR-216a-5p通过靶向ITCH加重DOXIC

图7a：生物信息学预测显示，ITCH是miR-216a-5p的潜在靶基因，其3’UTR存在保守结合位点（CUUAACAUGAGA-UUU-AACA）。

图7b-d：共培养实验中，miR-216a-5p mimic显著下调ITCHmRNA表达，Venn分析确认ITCH为唯yi共同下调基因。

图7e：不同物种间ITCH3’UTR与miR-216a-5p的结合位点高度保守，提示功能保守性。

图7f：荧光素酶报告实验证实，miR-216a-5p与ITCH3’UTR直接结合，突变结合位点后抑制作用消失。

图7g：Dactinomycin实验显示，miR-216a-5p加速ITCHmRNA降解，降低其稳定性，导致ITCH蛋白水平下降。

图7h-l：ITCH过表达逆转miR-216a-5p诱导的心肌细胞损伤、LDH释放及焦亡标志物表达，而ITCH敲低则增强损伤。

这些结果表明，miR-216a-5p通过降解ITCHmRNA，抑制其泛素化功能，进而激活焦亡通路。

 

8、miR-216a-5p/ITCH轴通过减少TXNIP泛素化加重焦亡

图8a：免疫共沉淀显示，miR-216a-5p抑制ITCH介导的TXNIP泛素化，导致TXNIP蛋白积累，激活焦亡通路。

图8b：ITCH敲低进一步减少TXNIP泛素化，而过表达ITCH则恢复泛素化水平，逆转miR-216a-5p的促焦亡作用。

图8c-f：TXNIP敲低显著减轻miR-216a-5p诱导的心肌细胞死亡、LDH释放及IL-1β/IL-18分泌，提示TXNIP是焦亡关键介质。

图8g-k：Western blot显示，TXNIP敲低下调焦亡相关蛋白（NLRP3、GSDMD-N、CleavedCASP1）表达，证实TXNIP在焦亡中的核心作用。

这些结果表明，miR-216a-5p通过抑制ITCH介导的TXNIP泛素化降解，激活NLRP3炎症小体通路，最终导致心肌细胞焦亡。

 

9、心肌特异性miR-216a-5p海绵减轻体内DOXIC

图9a：AAV9-miR-216a-5p海绵病毒的心肌特异性递送实验设计，通过启动子实现心肌细胞靶向。

图9b-e：超声心动图显示，miR-216a-5p海绵显著改善DOX诱导的LVEF、LVFS下降及舒张功能异常（E/A、E/E’比值恢复），提示心功能保护。

图9f-j：组织染色显示，miR-216a-5p海绵减少心肌空泡化（HE染色）、纤维化（Sirius红染色）及萎缩（WGA染色），降低血浆BNP水平（心力衰竭标志物）。

图9k：Westernblot证实，miR-216a-5p海绵下调心肌组织中焦亡相关蛋白（GSDMD-N、CleavedCASP1）表达，抑制焦亡通路。

这些结果表明，抑制心肌中的miR-216a-5p可有效减轻乳腺癌外泌体加剧的DOX诱导心肌损伤，验证其治疗潜力。

 

10、抑制TXNIP/NLRP3/Caspase-1通路减轻DOXIC

图10a-c：Western blot显示，VX765（Caspase-1抑制剂）、MCC950（NLRP3抑制剂）、SRI-37330（TXNIP抑制剂）均剂量依赖性抑制DOX处理心肌细胞中CleavedCASP1、TXNIP和NLRP3蛋白表达。

图10d：PDX模型实验设计示意图，显示抑制剂给药时间和剂量。

图10e-h：超声心动图显示，三种抑制剂均显著改善DOX诱导的左心室功能异常（LVEF、LVFS、E/A和E/E’比值恢复）。

图10i：ELISA显示，抑制剂组血浆BNP水平显著低于DOX组，提示心力衰竭程度减轻。

图10j-o：组织染色显示，抑制剂减少心肌空泡化（HE）、纤维化（Sirius红）和萎缩（WGA），改善心肌结构损伤。

这些结果表明，靶向TXNIP/NLRP3/Caspase-1通路可有效减轻DOX诱导的心肌损伤，验证焦亡通路在DOXIC中的核心作用。

 

11、人类乳腺癌患者外泌体加重心肌细胞焦亡及miR-216a-5p抑制剂的逆转作用

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图11a：透射电镜和NTA显示，DOXIC患者血浆外泌体（Dis-EXOs）与健康人外泌体（N-EXOs）的形态和粒径分布相似，但Dis-EXOs中miR-216a-5p水平显著更高。

图11b-f：Dis-EXOs处理hiPSC-CMs后，细胞活力下降、LDH释放增加，焦亡相关蛋白（GSDMD-N、CleavedCASP1、NLRP3）和细胞因子（IL-1β、IL-18）表达上调，而miR-216a-5p抑制剂可逆转这些效应。

图11g：Western blot显示，Dis-EXOs下调心肌细胞ITCH蛋白表达，上调TXNIP表达，miR-216a-5p抑制剂恢复ITCH和TXNIP水平。

这些结果表明，人类乳腺癌患者外泌体通过miR-216a-5p/ITCH/TXNIP轴诱导心肌细胞焦亡，miR-216a-5p抑制剂具有临床转化潜力。

 

结论

本研究揭示了乳腺癌与心脏之间通过外泌体传递miR-216a-5p的病理串扰机制：DOX诱导乳腺癌细胞中ATF3转录因子激活，促进miR-216a-5p转录；miR-216a-5p通过SF3B4包装入外泌体并传递至心肌细胞，靶向ITCHmRNA使其降解，减少TXNIP泛素化并激活NLRP3炎症小体，最终导致心肌细胞焦亡和心脏毒性加重。抑制miR-216a-5p或阻断外泌体传递（如敲低Rab27a）可显著减轻DOXIC。该研究首次明确了“肿瘤-心脏”跨器官通信在化疗心脏毒性中的关键作用，为临床开发靶向miR-216a-5p或外泌体的心脏保护策略提供了理论依据。