聚焦外泌体前沿：揭秘神奇“外泌体”靶向巨噬细胞极化机制，探索1型糖尿病外泌体疗法新路径！

1型糖尿病（T1DM）是一种自身免疫性疾病，目前主流的胰岛素替代疗法虽能满足基本代谢需求，但存在引发致命性低血糖事件的风险，且无法预防相关并发症。此外，T1DM患者持续的免疫失调会加速疾病进展。

间充质干细胞（MSCs）具有多向分化潜能和免疫调节特性，其分泌的细胞外囊泡（如外泌体）在免疫调节中发挥重要作用。人脐带间充质干细胞来源的外泌体（hucMSC-EXOs）相比其他来源的间充质干细胞外泌体，具有易获取、免疫原性低等优势，在多种炎症疾病中显示出治疗潜力。因此本研究旨在系统探究hucMSC-EXOs在T1DM中的治疗潜力，并明确其免疫调节机制中的关键生物活性蛋白成分。

湾湾今天分享的是一篇发表在【Stem Cell Res Ther】（IF：7.3）上题为“hucMSC-derived exosomes targeting macrophage polarization attenuate systemic inflammation in T1DM via INS/SOD1 delivery”的研究，该研究使用链脲佐菌素诱导C57BL/6雄性小鼠患上1型糖尿病（T1DM），随后给其腹腔注射人脐带间充质干细胞外泌体（hucMSC-EXOs），随后对全身葡萄糖代谢、多器官病理变化以及巨噬细胞浸润情况进行评估，并在体外将THP-1细胞衍生的巨噬细胞诱导为M1型，用hucMSC-EXOs进行处理，最后通过蛋白质组学分析、药理抑制和功能测试来确定关键的外泌体成分。结果发现hucMSC-EXOs显著降低了1型糖尿病小鼠的高血糖症，恢复了其葡萄糖耐量，并减轻了胰腺、脾脏、肝脏、肾脏和心脏的结构损伤。蛋白质组分析显示，INS和超氧化物歧化酶1（SOD1）是hucMSC-EXOs中富集的抗炎蛋白。热失活消除了它们的生物活性，而对INS（S961）或SOD1（ATN-224）的药理抑制则逆转了hucMSC-EXOs对巨噬细胞活化的抑制作用。该研究揭示，hucMSC-EXOs通过协同传递胰岛素和超氧化物歧化酶1发挥其抗炎作用，为T1DM中由外泌体介导的免疫调节建立了一个以蛋白质为中心的机制。

 

研究成果

1、1型糖尿病小鼠多个器官的病理变化

图1 T1DM小鼠多器官的病理变化。

图1A：1型糖尿病小鼠模型建立的示意图。

图1B：对照组（CON）和T1DM小鼠的外观图像。结果显示T1DM小鼠体型较小。

图1C-F：两组小鼠的生理和代谢指标，包括食物摄入量、饮水量、体重和血糖水平。结果显示T1DM小鼠表现出多食、多饮、体重下降和持续高血糖。

图1G-H：通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）评估的葡萄糖代谢情况。结果显示T1DM小鼠存在高血糖、葡萄糖耐量受损和葡萄糖稳态紊乱。

图1I：对两组小鼠胰腺、脾脏、肝脏、肾脏和心脏进行HE染色。结果显示，T1DM小鼠多器官出现明显结构损伤，如胰岛萎缩、脾红白髓界限模糊、肝细胞水肿等。

图1J-N：两组小鼠血清中多器官功能损伤标志物的浓度。结果显示T1DM小鼠胰腺β细胞功能标志物C肽（Cp）水平显著降低，肝损伤标志物（ALT、AST）和肾功能标志物（Cr、BUN）水平升高。

这些结果表明，T1DM小鼠出现了明显的代谢紊乱和多器官结构及功能异常，成功构建了T1DM小鼠模型。

 

2、巨噬细胞炎症激活会引发1型糖尿病小鼠的多器官损伤

图2 巨噬细胞炎性激活促进T1DM小鼠多器官损伤。

图2A-D：对照组和T1DM小鼠胰腺、脾脏、肝脏和心脏中F4/80阳性巨噬细胞的免疫组化（IHC）染色结果。结果显示T1DM小鼠这些器官中巨噬细胞浸润显著增加。

图2E-G：流式细胞术检测到的胰腺、脾脏和肝脏中F4/80阳性巨噬细胞比例。结果显示T1DM小鼠阳性巨噬细胞比例显著高于对照组。

图2H-L：qPCR检测到的脾、胰腺、肝、肾和心脏中炎症细胞因子（IL-6、CCL-2、TNF-α等）的mRNA表达水平。结果显示T1DM小鼠这些细胞因子表达显著上调。

图2M-U：流式细胞术检测到的胰腺、脾脏和肝脏中浸润巨噬细胞分泌的IL-6、CCL-2、TNF-α蛋白水平。结果显示T1DM小鼠显著升高。

这些结果表明，巨噬细胞的炎性激活是T1DM小鼠多器官功能障碍的重要促进因素。

 

3.、hucMSC-EXOs可逆转1型糖尿病小鼠的病理表型

图3 hucMSC-EXOs逆转T1DM小鼠的病理表型。

图3A：T1DM小鼠腹腔注射hucMSC-EXOs的给药实验示意图。

图3B：CON、T1DM和hucMSC-EXOs处理组（EXOs）小鼠的外观图像。结果显示EXOs组小鼠体型较T1DM组有所恢复。

图3C-F：三组小鼠的食物摄入量、饮水量、体重和血糖水平。结果显示EXOs组小鼠的多食、多饮、体重下降症状得到缓解，血糖水平显著降低。

图3G-H：三组小鼠的OGTT和ITT结果。结果显示EXOs组小鼠的胰腺β细胞功能和胰岛素敏感性得到改善。

图3I：三组小鼠多器官的HE染色结果。结果显示EXOs组小鼠的胰腺、脾脏、肝脏、肾脏和心脏的结构损伤显著减轻。

图3J-N：三组小鼠血清中多器官功能损伤标志物的浓度。结果显示EXOs组小鼠的Cp水平显著升高，肝、肾相关功能标志物水平降至接近正常。

这些结果表明，hucMSC-EXOs可改善T1DM小鼠的多种病理表型，恢复多器官的结构和功能。

 

4、 hucMSC-EXOs可抑制1型糖尿病小鼠体内巨噬细胞的浸润

图4 hucMSC-EXOs抑制T1DM小鼠的巨噬细胞浸润。

图4A-D：对CON、T1DM和EXOs组小鼠胰腺、脾脏、肝脏和心脏中F4/80阳性巨噬细胞进行IHC染色。结果显示，EXOs组小鼠这些器官中巨噬细胞数量显著低于T1DM组。

图4E-G：流式细胞术检测到的三组小鼠胰腺、脾脏和肝脏中F4/80阳性巨噬细胞的比例。结果显示EXOs组阳性巨噬细胞的比例显著降低。

这些结果表明，hucMSC-EXOs通过减少T1DM小鼠病变组织中的巨噬细胞浸润，修复多组织的炎性损伤。

 

5、hucMSC-EXOs可抑制1型糖尿病小鼠巨噬细胞的炎症激活过程

图5 hucMSC-EXOs抑制T1DM小鼠巨噬细胞的炎症激活现象。

图5A-E：qPCR检测到的CON、T1DM和EXOs组小鼠脾、胰腺、肝、肾和心脏中炎症细胞因子的mRNA表达水平、结果显示EXOs组mRNA表达水平显著低于T1DM组。

图5F-N：流式细胞术检测到的三组小鼠胰腺、脾脏和肝脏中浸润巨噬细胞分泌的IL-6、CCL-2、TNF-α蛋白水平。结果显示EXO组IL-6、CCL-2、TNF-α蛋白水平显著降低。

这些结果表明，hucMSC-EXOs通过抑制巨噬细胞的促炎激活，逆转T1DM小鼠的多器官炎性表型。

 

6、人脐带间充质干细胞外泌体中的抗炎蛋白成分

图6 hucMSC-EXOs中的抗炎蛋白成分。

图6A-F：通过qPCR比较热灭活的hucMSC-EXOs和未处理的hucMSC-EXOs对巨噬细胞中炎症细胞因子表达水平的影响。结果显示热灭活的hucMSC-EXOs抗炎活性显著降低。

图6G：通过STRING数据库对hucMSC-EXOs蛋白进行拓扑分析。结果识别出INS和SOD1等关键枢纽蛋白。

图6H-K：通过ELISA检测hucMSCs培养上清液和hucMSC-EXOs中INS和SOD1的含量。结果显示hucMSC-EXOs中这两种蛋白含量显著富集。

图6L-O：通过qPCR分析EXOs单独处理、EXOs联合S961（INS受体拮抗剂）及EXOs联合ATN-224（SOD1抑制剂）对巨噬细胞中炎症因子表达的影响。结果显示联合处理组炎症因子表达水平较EXOs单独处理组升高。

图6P：Western blot分析不同处理对巨噬细胞中PI3K/AKT和P65磷酸化的影响。结果显示联合处理组的相关磷酸化水平发生改变。

这些结果表明，INS和SOD1是hucMSC-EXOs中发挥抗炎作用的关键蛋白成分。

 

7、抑制剂INS和SOD1可逆转hucMSC-EXOs在1型糖尿病小鼠体内的抗炎作用

图7 S961和ATN-224部分逆转hucMSC-EXOs对T1DM小鼠的治疗效果。

图7A：T1DM小鼠接受S961、ATN-224和hucMSC-EXOs联合治疗的方案示意图。

图7B：T1DM、EXOs、EXOs+S961和EXOs+ATN-224组小鼠的外观图像。结果显示联合治疗组小鼠的外观改善程度不及EXOs组。

图7C-F：四组小鼠的食物摄入量、饮水量、体重和血糖水平。结果显示联合治疗组的症状缓解和血糖降低效果不及EXOs组。

图7G-H：四组小鼠的OGTT和ITT结果。结果显示联合治疗组小鼠的胰腺β细胞功能和胰岛素敏感性改善程度不及EXOs组。

图7I：四组小鼠多器官的HE染色结果。结果显示联合治疗组小鼠的器官结构损伤改善程度不及EXOs组。

图7J-N：四组小鼠血清中多器官功能损伤标志物的浓度。结果显示联合治疗组的标志物水平改善程度不及EXOs组。

图8 S961和ATN-224逆转hucMSC-EXOs介导的多器官抗炎作用。

图8A-D：多组小鼠胰腺、脾脏、肝脏和心脏中F4/80阳性巨噬细胞的IHC染色结果。结果显示联合治疗组巨噬细胞数量多于EXOs组。

图8E-G：流式细胞术检测到的多组小鼠胰腺、脾脏和肝脏中F4/80阳性巨噬细胞的比例。结果显示联合治疗组阳性巨噬细胞的比例显著高于EXOs组。

图8H-P：流式细胞术分析多组小鼠胰腺、脾脏和肝脏中浸润巨噬细胞分泌的IL-6、CCL-2、TNF-α蛋白水平。结果显示联合治疗组蛋白水平显著高于EXOs组。

这些结果表明，S961和ATN-224可部分逆转hucMSC-EXOs对T1DM小鼠的治疗效果（图7），还可逆转hucMSC-EXOs在T1DM小鼠多器官中的抗炎作用（图8）。

 

结论

本研究表明，hucMSC-EXOs通过递送INS和SOD1靶向巨噬细胞极化，减轻T1DM小鼠的全身性炎症，改善高血糖和多器官炎症损伤。这一发现建立了外泌体介导的T1DM免疫调节中以蛋白质为中心的机制，为T1DM新型免疫疗法的开发提供了重要理论依据。外泌体在炎症性疾病治疗中的潜力正不断被挖掘，本研究中hucMSC-EXOs通过递送INS和SOD1调控巨噬细胞极化，为1型糖尿病治疗提供了新方向！