RBMX去SUMO化给外泌体miRNA“装导航”，靶向调控DKD纤维化，这波研究思路超硬核！

糖尿病肾病（DKD）是我国慢性肾衰竭的主要病因，肾小管间质纤维化是其进展为终末期肾病的核心机制。外泌体作为肾脏病理变化的“信使”，其携带的miRNA组成受RNA结合蛋白（RBPs）调控。RBMX作为异质核核糖核蛋白家族成员，可通过结合RNA调控外泌体内容物分选，但在DKD中的作用尚不明确。

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今天分享的是发表在【J Adv Res】（IF：13）上题为“DeSUMOylation of RBMX regulates exosomal sorting of cargo to promote renal tubulointerstitial fibrosis in diabetic kidney disease”的研究。该研究旨在探索RBMX对DKD中肾小管上皮细胞外泌体miRNA分选的调控机制，明确其在肾小管间质纤维化和线粒体损伤中的作用，为DKD的治疗提供新靶点。

 

研究结果

1.DKD中肾小管上皮细胞RBMX高表达

图1A：HE、PAS和Masson染色显示，HFD/STZ诱导的DKD小鼠肾皮质出现肾小球系膜基质扩张、肾小管萎缩和胶原沉积；免疫组化显示RBMX主要定位于肾小管，且表达量较对照组显著增加。

图1B：DKD小鼠尿白蛋白/肌酐比值（UACR）显著升高，提示肾损伤加重。

图1C：对HFD/STZ诱导的DKD小鼠肾皮质中RBMX表达进行半定量分析（ImageJ检测平均光密度），结果显示DKD组RBMX表达水平显著高于对照组。

图1D：qRT-PCR显示，HFD/STZ诱导的DKD小鼠肾皮质中Rbmx mRNA表达水平显著高于对照组。

图1E：高糖（HG）处理的HK-2细胞中，纤维化指标（FN、TGFβ1、CCN2）及RBMX的mRNA表达均较正常糖（LG）组显著上调。

图1F：Western blot显示，HG处理的HK-2细胞中，FN、TGFβ1、CCN2及RBMX蛋白表达水平较LG组显著增加。

这些结果表明，RBMX在DKD模型（体内和体外）的肾小管上皮细胞中高表达，且与肾损伤及纤维化指标升高相关。

 

2.RBMX促进DKD肾小管间质纤维化

 

图2A：qRT-PCR显示，肾过表达Rbmx的HFD/STZ小鼠肾皮质中，Rbmx、Fn、Tgfb1、Ccn2的mRNA表达水平显著高于对照组。

图2B：免疫组化及HE、PAS、Masson染色显示，过表达Rbmx加剧DKD小鼠肾小球基底膜增生、肾小管萎缩和间质纤维化，且RBMX及纤维化标志物（FN、TGFβ1、CCN2）表达显著增加。

图2C：过表达Rbmx的DKD小鼠尿白蛋白/肌酐比值（UACR）进一步升高，提示肾损伤加重。

图2D：HG处理的HK-2细胞转染RBMX过表达质粒后，RBMX、FN、TGFβ1、CCN2的mRNA表达显著上调。

图2E：Western blot验证上述蛋白表达相应增加。

图2F：HG处理的HK-2细胞转染si-RBMX后，RBMX及纤维化因子的mRNA表达显著降低。

图2G：Western blot显示上述蛋白表达水平相应降低。

这些结果表明，RBMX可促进DKD肾小管间质纤维化，过表达RBMX加剧损伤，敲低则缓解。

 

3.RBMX加剧DKD线粒体损伤

图3A：Western blot显示，HG处理的HK-2细胞过表达RBMX后，线粒体呼吸链复合体蛋白（NDUFB8、SDHB、UQCRC2、MT-CO1）表达显著降低。

图3B：MitoSOX检测显示，线粒体ROS水平显著升高。

图3C：ATP检测显示，细胞内ATP含量显著减少。

图3D：HG处理的HK-2细胞转染si-RBMX后，上述线粒体呼吸链蛋白表达显著回升。

图3E：线粒体ROS水平显著降低。

图3F：ATP含量显著增加。

图3G-H：免疫组化及定量分析显示，过表达Rbmx的DKD小鼠肾皮质中，NDUFB8、SDHB等线粒体蛋白表达显著降低。

这些结果表明，RBMX通过降低线粒体呼吸链复合体蛋白表达、减少ATP生成及增加ROS，加剧DKD线粒体损伤。

 

4.RBMX通过外泌体释放miRNA调控线粒体损伤

图4A：qRT-PCR显示，过表达Rbmx的HFD/STZ小鼠肾皮质中，miR-26a、miR-23c、miR-874等miRNA表达显著降低。

图4B：db/db小鼠肾皮质中，上述miRNA表达同样降低。

图4C-D：HFD/STZ和db/db小鼠肾外泌体中，miR-26a、miR-23c、miR-874表达显著升高。

图4E：HG处理的HK-2细胞过表达RBMX后，细胞内上述miRNA表达降低。

图4F：其分泌的外泌体中上述miRNA表达升高。

图4G-H：敲低RBMX后，细胞内miRNA表达升高，外泌体中降低。

图4I：Western blot显示，敲低RAB27A（抑制外泌体分泌）后，外泌体标志物TSG101、CD63表达降低。

图4J-K：敲低RAB27A可逆转RBMX过表达诱导的纤维化标志物（FN、TGFβ1）升高及线粒体蛋白（NDUFB8等）降低。

图4L-M：ATP含量回升，线粒体ROS减少。

这些结果表明，RBMX通过调控外泌体分选miR-26a、miR-23c、miR-874，促进线粒体损伤和纤维化，抑制外泌体分泌可逆转该效应。

 

5.去SUMO化的RBMX促进外泌体miRNA分选及肾小管间质纤维化

 

图5A：Co-IP显示，HK-2细胞中RBMX可与SUMO1、SUMO2/3结合。

图5B：HEK-293T细胞中，RBMX与SUMO3结合最强（His-UBC9共转染）。

图5C：HG处理的HK-2细胞中，RBMX的SUMO2/3修饰水平显著降低。

图5D-E：Western blot显示，RBMX的K22R、K80R突变（预测SUMO化位点）可抑制其SUMO化，其中K80R效果更显著。

图5F：Co-IP显示，RBMX与外泌体标志物TSG101结合增强。

图5G：免疫荧光显示，RBMX K80R突变体在CD63阳性多囊泡体（MVBs）中富集。

图5H-I：HK-2细胞转染RBMX K80R后，细胞内miR-26a、miR-23c、miR-874表达降低，外泌体中升高。

图5J：Western blot显示，K80R突变体组纤维化标志物（TGFβ1、CCN2）升高，线粒体蛋白（NDUFB8等）降低。

这些结果表明，RBMX的K80位点去SUMO化可促进其与外泌体相关蛋白结合，增强外泌体miRNA分选，加剧纤维化和线粒体损伤。

 

6.RBMX直接结合miRNA介导其外泌体分选

图6A：序列分析显示，miR-26a、miR-23c、miR-874含CCAG基序，可与RBMX结合。

图6B：RIP实验显示，HG或BSA处理后，HK-2细胞中RBMX与上述miRNA的结合显著增加。

图6C：Western blot显示，HG处理的HK-2细胞共转染RBMX过表达质粒与miRNA mimic后，纤维化标志物（FN、TGFβ1）降低，线粒体蛋白（NDUFB8等）回升。

图6D：qRT-PCR验证纤维化因子mRNA降低。

图6E-F：ATP含量增加，线粒体ROS减少。

这些结果表明，RBMX通过直接结合miR-26a、miR-23c、miR-874，调控其外泌体分选，进而影响线粒体功能和纤维化。

 

7.miR-26a、miR-23c、miR-874作为保护性miRNA在DKD中发挥作用

 

图7A-B：qRT-PCR和Western blot显示，HG处理的HK-2细胞转染上述miRNA mimic后，纤维化标志物（FN、TGFβ1）降低，线粒体蛋白（NDUFB8等）升高。

图7C-D：ATP含量增加，线粒体ROS减少。

图7E-F：转染miRNA抑制剂后，纤维化标志物升高，线粒体蛋白降低。

图7G-H：ATP含量减少，线粒体ROS增加。

这些结果表明，miR-26a、miR-23c、miR-874是保护性miRNA，可抑制DKD中的纤维化和线粒体损伤。

 

8.CERS6是miR-26a、miR-23c、miR-874的共同靶基因

图8A：靶基因预测显示，CERS6是三者的共同靶基因。

图8B：qRT-PCR显示，HG处理的HK-2细胞中CERS6 mRNA表达显著升高。

图8C：序列分析显示，三者与CERS63'UTR存在结合位点。

图8D-F：双荧光素酶实验显示，miRNA mimic可显著降低野生型CERS63'UTR的luciferase活性，突变型无显著变化。

图8G-J：HG处理的HK-2细胞转染miRNA mimic或si-RBMX后，CERS6蛋白表达降低。

图8K-N：过表达RBMX或Rbmx的HK-2细胞及DKD小鼠中，CERS6蛋白表达升高。

这些结果表明，miR-26a、miR-23c、miR-874通过靶向抑制CERS6，减轻DKD中的线粒体损伤和纤维化。

 

结论

本研究证实，在糖尿病肾病（DKD）中，肾小管上皮细胞中高表达的RBMX通过其K80位点的去SUMO化修饰，增强与miR-26a、miR-23c、miR-874的结合，并促进这些保护性miRNA分选至外泌体中分泌。这导致细胞内保护性miRNA减少，其对靶基因CERS6的抑制作用减弱，CERS6异常升高，最终加剧线粒体损伤和肾小管间质纤维化。该研究揭示了RBMX的去SUMO化在调控外泌体miRNA分选及DKD进展中的关键作用，提示靶向抑制RBMX表达或干预其去SUMO化过程，可能成为DKD治疗的新策略。