外泌体-脂质体杂化：DR5 靶向+双药共递+代谢调控三重buff拉满，精准打击肺转移黑色素瘤，从机制到PDX模型全是硬货！

 

 

肺转移性黑色素瘤（PMM）是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，对化疗、放疗、免疫治疗等现有疗法响应有限，且易快速产生耐药性，患者5年生存率不足17%。雷公藤甲素（TP）作为一种具有抗肿瘤活性的天然化合物，因被CYP3A4酶快速代谢（约90%的TP代谢由其介导），导致半衰期短、治疗窗窄，且全身毒性显著，限制了临床应用。

今天分享的是发表在【Science Advances】（IF：12.5）上题为“Engineering hybrid nanoparticles for targeted codelivery of triptolide and CYP3A4-siRNA against pulmonary metastatic melanoma”的研究，该研究开发了一种靶向仿生递送系统TP-siRC@tHyNPs：将高表达DR5单链可变片段（DR5-scFv）的工程化外泌体（DR5-Exo）与共包载TP和CYP3A4-siRNA的脂质体（TP-siRC@Lip）融合，通过DR5-scFv与肿瘤细胞表面DR5受体的特异性结合实现靶向递送，同时利用CYP3A4-siRNA抑制TP代谢以延长其作用时间，最终协同增强抗肿瘤效果并降低毒性。

 

研究结果

1、TP-siRC@tHyNPs的制备及抗PMM协同作用示意图

图1A：制备流程示意图。通过慢病毒转染构建高表达DR5-scFv的293T细胞，分离其分泌的DR5-Exo；将TP和CYP3A4-siRNA包载入脂质体（TP-siRC@Lip）；通过冻融法将DR5-Exo与TP-siRC@Lip融合，形成TP-siRC@tHyNPs。

图1B：作用机制示意图。尾静脉注射后，TP-siRC@tHyNPs通过DR5-scFv靶向识别PMM细胞表面DR5受体并被内化；CYP3A4-siRNA抑制TP代谢，延长其半衰期；TP与DR5-scFv协同激活凋亡通路、诱导免疫原性细胞死亡（ICD）、重塑巨噬细胞表型，最终抑制肿瘤生长和转移。

这些结果表明，TP-siRC@tHyNPs通过“靶向递送-代谢调控-多机制协同”模式，实现对PMM的高效治疗。

 

2、DR5-scFv的构建及抗肿瘤效果验证

图2A：分子对接显示DR5-scFv（模型01和02）与DR5受体存在特异性结合界面，通过氢键等相互作用稳定结合。

图2B-C：考马斯亮蓝染色和Western blot验证DR5-scFv在293T细胞培养液中成功表达并纯化。

图2D：生物层干涉法测定DR5-scFv与DR5受体的结合常数为7×10^-⁸M，表明高亲和力。

图2E-F：RT-qPCR和考马斯亮蓝染色证实DR5-scFv在293T-DR5-scFv细胞中稳定表达。

图2G-J：动物实验显示，DR5-scFv处理组A375M荷瘤小鼠的肿瘤体积、重量显著小于对照组，且肿瘤生长曲线斜率更低。

图2K-L：HE染色显示DR5-scFv组肿瘤组织出现明显坏死；TUNEL染色显示凋亡细胞比例显著增加。

这些结果表明，DR5-scFv可通过特异性结合DR5受体抑制PMM细胞增殖并诱导凋亡，具有直接抗肿瘤活性。

 

3、TP-siRC@tHyNPs的制备与表征

图3A-B：透射电镜（TEM）和免疫电镜显示DR5-Exo呈典型囊泡结构，表面可见DR5-scFv标记。

图3C：Western blot证实DR5-Exo表达外泌体标志物CD9、CD63、TSG101及DR5-scFv的表达。

图3D-E：TEM显示脂质体（Lip）和TP包载脂质体（TP@Lip）为球形，粒径均一。

图3F：当TP与脂质质量比为1:10时，包封率（EE%）达86.17±5.36%，载药量（DL%）为9.25±0.59%。

图3G-H：Westernblot显示CYP3A4-siRNA（siRNA1）对A375M细胞中CYP3A4的抑制率达51.84±6.55%，但传代后表达略有回升。

图3I-J：琼脂糖凝胶电泳（AGE）显示N/P比3:1时TP-siRC@Lip形成稳定复合物；TEM显示其为球形（约135nm）。

图3K-L：冻融法融合DR5-Exo与TP-siRC@Lip（质量比2:1）形成TP-siRC@tHyNPs，zeta电位稳定在-11mV左右。

图3M：荧光共振能量转移（FRET）证实DR5-Exo与TP-siRC@Lip成功融合（荧光强度下降）。

图3N-O：TEM和免疫电镜显示TP-siRC@tHyNPs为融合囊泡结构，表面保留DR5-scFv。

图3P：Western blot证实TP-siRC@tHyNPs同时表达外泌体标志物和DR5-scFv。

图3Q：pH响应释放曲线显示，pH5.5（模拟内体环境）下4小时TP释放率达79.46±4.14%，显著高于pH7.4（生理环境）。

图3R：稳定性实验显示，TP-siRC@tHyNPs在血浆、PBS中储存及稀释后粒径无显著变化。

这些结果表明，TP-siRC@tHyNPs制备工艺稳定，具有理想的理化性质、pH响应释放特性和生物稳定性，可高效共递送TP和CYP3A4-siRNA。

 

4、细胞内摄取、分布及代谢分析

图4A：共聚焦显示，DiD标记的TP-siRC@Lip（红色）主要分布在A375M细胞核周围，PKH67标记的DR5-Exo（绿色）内化效率高于未修饰外泌体（Exo）。

图4B：双标共聚焦显示，TP-siRC@tHyNPs组（DR5-Exo+TP-siRC@Lip）的细胞内荧光共定位（黄色）强度显著高于TP-siRC@HyNPs组（未修饰Exo+TP-siRC@Lip）。

图4C：定量分析显示，TP-siRC@tHyNPs组的脂质体（红色）和外泌体（绿色）荧光强度均最高。

图4D：流式细胞术显示，TP-siRC@tHyNPs在A375M细胞中的摄取呈时间依赖性，4小时达峰（MFI最高）。

图4E：细胞药代动力学显示，TP-siRC@tHyNPs组TP半衰期（t₁/₂=5.08±0.51h）是游离TP组（1.71±0.45h）的2.97倍，AUC和Cmax显著升高；CYP3A4过表达则加速TP清除（t₁/₂=0.64±0.12h）。

这些结果表明，DR5修饰增强了TP-siRC@tHyNPs的细胞靶向摄取，且CYP3A4-siRNA可有效延长TP的细胞内半衰期。

 

5、体外抗肿瘤活性评估

图5A-B：CCK-8实验显示，TP-siRC@tHyNPs对A375M细胞的增殖抑制率（IC50最低）显著高于TP单药、TP&siRC@HyNPs（物理混合组）等，且呈浓度依赖性。

图5C-G：3D肿瘤球模型中，TP-siRC@tHyNPs组的凋亡荧光强度最高，肿瘤球体积最小。

图5D-H：流式凋亡检测显示，TP-siRC@tHyNPs组A375M细胞凋亡率达82.69±2.48%，显著高于其他组。

图5E-I：Transwell实验显示，TP-siRC@tHyNPs对细胞侵袭的抑制率达21.78±3.16%。

图5F-J：划痕实验显示，其对细胞迁移的抑制率达13.83±5.41%。

这些结果表明，TP-siRC@tHyNPs在体外可显著抑制PMM细胞增殖、诱导凋亡并阻断侵袭迁移。

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6、体外抗肿瘤机制研究

图6A-B：共聚焦显示，TP-siRC@tHyNPs组A375M细胞表面钙网蛋白（CRT）暴露增加，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放增多，提示诱导ICD。

图6C：流式显示，TP-siRC@tHyNPs处理可促进树突状细胞（DCs）成熟（CD80⁺CD86⁺比例最高）。

图6D：流式显示，TP-siRC@tHyNPs可将M2型巨噬细胞（CD206⁺F4/80⁺）重编程为M1型（CD86⁺），M2标志物表达降低。

图6E：细胞周期分析显示，TP-siRC@tHyNPs组S期细胞比例显著升高，提示S期阻滞。

图6F：Western blot显示，TP-siRC@tHyNPs组凋亡相关蛋白（Cleaved-caspase3/8/9、Bax、Cyto-C）表达上调，抗凋亡蛋白（Bcl-2、Survivin）及VEGF、p-JAK2、p-STAT3表达下调。

这些结果表明，TP-siRC@tHyNPs通过诱导ICD、重塑巨噬细胞表型、阻滞细胞周期及激活内源性/外源性凋亡通路发挥抗肿瘤作用。

 

7、TP-siRC@tHyNPs 的体内药代动力学与生物分布

图7A-C：活体成像显示，TP-siRC@tHyNPs在PMM模型小鼠肺部的荧光信号强度最高，且12小时仍保持高滞留，其他器官分布较少。

图7D：血浆药代动力学显示，TP-siRC@tHyNPs组TP半衰期（t₁/₂）是游离TP组的58倍，AUC显著增加。

图7E：组织分布显示，TP-siRC@tHyNPs在肺组织（肿瘤部位）的药物浓度显著高于其他组，且12小时仍维持较高水平。

这些结果表明，TP-siRC@tHyNPs可特异性靶向富集于肺部转移灶，显著延长TP的体内半衰期。

 

8、体内抗PMM效果评估

图8A：实验设计：A375M肺转移模型小鼠每3天尾静脉注射一次药物，共7次，监测肿瘤及生存情况。

图8B-I：Bouin染色显示，TP-siRC@tHyNPs组肺转移结节总数（TNMN）显著减少；HE染色显示肺组织结构更完整，肿瘤浸润少；Ki67（增殖标志物）表达降低，Cleaved-caspase3和TUNEL阳性细胞（凋亡）及CRT（ICD）表达显著增加。

图8J：生存曲线显示，TP-siRC@tHyNPs组小鼠中位生存期最长（>70天），显著高于对照组（<30天）。

这些结果表明，TP-siRC@tHyNPs可显著抑制PMM肺转移，延长荷瘤小鼠生存期。

 

9、患者来源异种移植（PDX）模型中的疗效验证

图9A：实验设计。将患者转移灶组织移植到B-NDG小鼠，建立PDX模型，评估TP-siRC@tHyNPs的疗效。

图9B-E：TP-siRC@tHyNPs组肿瘤体积、重量最小，抑制率达91.00±3.83%。

图9F：生存曲线显示，TP-siRC@tHyNPs组PDX小鼠生存期最长（>110天）。

图9G-K：HE显示肿瘤坏死明显；TUNEL、Cleaved-caspase3阳性细胞增加，Ki67降低，CRT暴露增加，验证了凋亡和ICD诱导效果。

这些结果表明，TP-siRC@tHyNPs在PDX模型中仍具有显著抗肿瘤活性，临床转化潜力高。

 

结论

本研究针对肺转移性黑色素瘤（PMM）治疗中现有疗法响应有限、雷公藤甲素（TP）代谢快且毒性大的问题，成功构建了靶向杂化纳米递送系统TP-siRC@tHyNPs。该系统通过融合高表达DR5单链可变片段（DR5-scFv）的工程化外泌体与共包载TP和CYP3A4-siRNA的脂质体，实现了多重协同效应：DR5-scFv介导对PMM细胞的特异性靶向，提升药物在肺部转移灶的富集；CYP3A4-siRNA有效抑制TP代谢，显著延长其半衰期（体内延长58倍）；TP与DR5-scFv协同通过诱导免疫原性细胞死亡、重塑巨噬细胞表型、阻滞细胞周期及激活凋亡通路，强效抑制肿瘤生长与转移。在动物模型及患者来源异种移植（PDX）模型中，TP-siRC@tHyNPs均显著减少肺转移结节、延长生存期，且无明显系统毒性。该研究不仅为PMM的精准治疗提供了新型策略，也为解决天然药物代谢快、靶向性差的问题奠定了实验基础，具有重要的临床转化价值。

 

 

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