【Adv Sci】14+，工程化外泌体“新标杆”！IgG Fc修饰构建TExo-Fc，多技术验证+巨噬细胞吞噬，免疫应答直接拉满！

肿瘤来源外泌体（TExo）是阻碍抗肿瘤治疗的关键因素，其携带的PD-L1可耗尽CD8⁺细胞毒性T细胞以抑制免疫应答，还能在远端器官构建前转移微环境促进肿瘤转移。更关键的是，临床一线化疗药物（如阿霉素DOX）会刺激肿瘤释放更多TExo，加剧免疫抑制与转移风险，形成治疗恶性循环。现有TExo清除策略存在明显局限，GW4869等抑制剂仅能抑制TExo生成，无法清除已进入循环的TExo；适配体修饰纳米材料依赖TExo表面特异性标志物，阳性率低限制应用。

 

今天分享的是发表在【Advanced Science】（IF：14.1）上题为“Enhancing Chemotherapy‐Related Immune Responses via Bioorthogonal Metabolic Engineering‐Driven Tumor Exosomes Elimination”的研究。该研究开发“生物正交反应驱动外泌体清除（Biordee）”策略，通过代谢糖工程标记内源性TExo，结合生物正交反应将IgG Fc片段修饰于TExo表面（TExo-Fc），利用IgG Fc与巨噬细胞FcγRII/III受体的相互作用促进TExo吞噬，旨在打破化疗相关免疫抑制、抑制肿瘤转移，为增强化疗疗效提供新方案。

 

研究结果

1、Biordee策略清除TExo的机制示意图

图1A：TExo-Fc构建与吞噬机制：①代谢糖工程：Man@Lip（甘露糖-N₃脂质体）被肿瘤细胞摄取，通过糖代谢将N₃基团标记于肿瘤细胞膜；②生物正交反应：肿瘤细胞分泌携带N₃的TExo（TExo-N₃），与DBCO修饰的IgG Fc（IgG Fc-DBCO）发生点击反应，生成TExo-Fc；③巨噬细胞吞噬：TExo-Fc表面的IgG Fc与巨噬细胞FcγRII/III受体结合，促进TExo被吞噬清除。

图1B：Biordee策略的治疗效应：①清除循环TExo，减少外泌体PD-L1介导的免疫抑制，增强化疗相关免疫应答；②阻断TExo构建前转移微环境的作用，抑制化疗诱导的乳腺癌肝转移；③DOX通过诱导肿瘤免疫原性死亡（ICD）激活免疫，Biordee策略通过清除TExo维持T细胞功能，二者协同增强抗肿瘤效果。

这些结果表明，Biordee策略通过“代谢标记-生物正交修饰-巨噬细胞吞噬”的三步流程，可针对性清除内源性TExo，同时解决化疗加剧TExo释放的问题，为协同增强化疗与免疫应答提供机制框架。

 

2、TExo-Fc的构建与表征

图2A：4T1细胞代谢标记验证。共聚焦成像显示，Man@Lip组4T1细胞膜被DBCO-CY5.5标记（红色荧光强），而PBS组、空白脂质体组、游离甘露糖-N₃组荧光弱，证实Man@Lip可高效通过糖代谢将N₃基团标记于肿瘤细胞膜。

图2B：TExo-Fc构建流程。TExo-N₃（肿瘤细胞分泌的N₃标记TExo）与IgG Fc-DBCO通过生物正交反应结合，生成TExo-Fc。

图2C：TExo-N₃的TEM表征。透射电镜显示TExo-N₃为典型杯状结构，粒径约100nm。

图2D：TExo-N₃的NTA分析。纳米颗粒追踪显示TExo-N₃粒径集中在80-120nm，浓度约1×10⁷particles/mL，符合外泌体特征。

图2E：TExo与TExo-N₃的Western blot验证。二者均表达外泌体标志物CD63、TSG101，且均携带immunosuppressive蛋白PD-L1，证实N₃标记不影响TExo的核心蛋白组成。

图2F：TExo与TExo-N₃的纳米流式分析。TExo-N₃被DBCO-CY5.5标记的阳性率（12.7%）显著高于未标记TExo（0.6%），证实N₃基团成功修饰于TExo表面。

图2G：IgG Fc-DBCO的考马斯亮蓝染色。IgG Fc-DBCO的电泳迁移速率慢于未修饰IgG Fc，且条带弥散，证实DBCO成功偶联于IgG Fc。

图2H：TExo-N₃与TExo-Fc的纳米流式分析。TExo-Fc的FITC荧光阳性率（5.9%）显著高于TExo-N₃（0.7%），证实IgG Fc通过生物正交反应成功修饰于TExo-N₃表面。

这些结果表明，通过代谢糖工程与生物正交反应，可高效构建TExo-Fc，且修饰过程不破坏TExo的基本结构与蛋白组成，为后续体内清除奠定基础。

 

3、IgG Fc促进巨噬细胞吞噬TExo

图3A：巨噬细胞吞噬TExo-Fc的机制示意图。TExo-Fc表面的IgG Fc与巨噬细胞表面FcγRII/III受体结合，触发吞噬信号，促进TExo-Fc被吞噬；加入抗FcγRII/III抗体可阻断该相互作用。

图3B：培养基中Exo-PD-L1的ELISA检测。与TExo组相比，TExo-Fc组培养基中PD-L1含量显著降低（约50%）；加入抗FcγRII/III抗体后，PD-L1含量回升，证实巨噬细胞通过FcγRII/III受体吞噬TExo-Fc。

图3C：巨噬细胞吞噬的共聚焦成像。DiO标记的TExo-Fc（绿色）与巨噬细胞（蓝色细胞核）共定位信号强，加入抗FcγRII/III抗体后共定位减弱，直观证实FcγRII/III介导的吞噬作用。

图3D：流式细胞术定量。TExo-Fc组巨噬细胞吞噬率（约45%）显著高于TExo组（约15%），抗FcγRII/III抗体可将吞噬率降至约20%，进一步验证吞噬机制。

这些结果表明，TExo-Fc可通过IgG Fc与FcγRII/III的相互作用，显著促进巨噬细胞吞噬TExo，且该过程可被FcγRII/III抗体特异性阻断，证实机制的特异性。

 

4、清除内源性TExo抑制肿瘤生长

图4A：乳腺癌化疗模型实验设计。4T1荷瘤小鼠分为5组（G1：对照；G2：DOX；G3：Man@Lip+IgG Fc-DBCO；G4：DOX+IgG Fc-DBCO；G5：DOX+Man@Lip+IgG Fc-DBCO），第0、5、15天瘤内注射Man@Lip，第1、6、16天静脉注射DOX，第2、7、17天静脉注射IgG Fc-DBCO，监测肿瘤生长至第24天。

图4B：外周血Exo-PD-L1的ELISA检测。G5组外周血Exo-PD-L1水平（约10pg/mL）显著低于G2组（约20pg/mL）和G4组（约15pg/mL），证实Biordee策略可有效清除循环TExo；同时观察到DOX组（G2）Exo-PD-L1高于对照组（G1），证实化疗刺激TExo释放。

图4C：肿瘤生长曲线。G5组肿瘤体积（约150mm³）显著小于G2组（约400mm³）、G3组（约350mm³）和G4组（约250mm³），证实Biordee策略与DOX协同抑制肿瘤生长。

图4D：小鼠生存曲线。G5组小鼠中位生存期（约30天）显著长于G2组（约20天）、G3组（约22天）和G4组（约25天），证实策略可改善预后。

图4E：肿瘤组织HE染色。G5组肿瘤组织坏死区域显著大于其他组，证实协同治疗加剧肿瘤组织损伤。

图4F：肿瘤组织TUNEL染色。G5组TUNEL阳性细胞比例（约30%）显著高于其他组（G2组约10%，G4组约15%），证实协同治疗促进肿瘤细胞凋亡。

这些结果表明，Biordee策略可在体内有效清除化疗诱导释放的TExo，与DOX协同抑制肿瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡，并延长荷瘤小鼠生存期，且无明显毒性。

 

5、清除内源性TExo增强全身抗肿瘤免疫应答

图5A：DOX诱导免疫应答的机制示意图。DOX诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡（ICD），释放ATP、HMGB1、CRT等损伤相关分子模式（DAMPs），激活树突状细胞（DC），进而促进T细胞活化与增殖。

图5B：脾脏DC成熟的流式分析。G5组CD11c⁺CD80⁺成熟DC比例（约7%）显著高于G2组（约4%）和G4组（约5%），证实清除TExo可进一步促进DC成熟；G3组（无DOX）也观察到DC成熟（约3%），推测与IgG Fc介导的抗体依赖细胞吞噬（ADCP）相关。

图5C：血清细胞因子的ELISA检测。G5组血清中IFN-γ（约500pg/mL）、TNF-α（约450pg/mL）、IL-2（约200pg/mL）水平显著高于G2组和G4组，证实清除TExo增强免疫细胞分泌促炎细胞因子。

图5D：脾脏记忆T细胞的流式分析。G5组CD44⁺CD62L⁺记忆T细胞比例（约7%）显著高于G2组（约3%）和G4组（约4%），证实清除TExo可促进记忆T细胞生成，有助于预防肿瘤复发。

图5E：脾脏T细胞的免疫荧光。G5组CD4⁺T细胞（红色）和CD8⁺T细胞（绿色）浸润密度显著高于其他组，直观证实全身T细胞应答增强。

这些结果表明，清除TExo可通过促进DC成熟、增强细胞因子分泌、增加记忆T细胞比例，强化DOX诱导的全身抗肿瘤免疫应答，为免疫协同治疗提供依据。

 

6、清除内源性TExo改善肿瘤免疫微环境

图6A：肿瘤组织T细胞的免疫荧光。G5组肿瘤内CD4⁺T细胞（红色）和CD8⁺T细胞（绿色）浸润密度显著高于G2组、G3组和G4组，证实清除TExo促进T细胞向肿瘤微环境浸润。

图6B：肿瘤组织免疫抑制性细胞的流式分析。G5组CD4⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg，约2%）和F4/80⁺CD206⁺M2型巨噬细胞（约3%）比例显著低于G2组（Treg约5%，M2约7%）和G4组（Treg约4%，M2约5%），证实清除TExo可减少免疫抑制性细胞浸润。

这些结果表明，Biordee策略可通过“促进T细胞浸润+减少免疫抑制性细胞”双重作用，重塑肿瘤免疫微环境，打破免疫抑制状态。

 

7、清除内源性TExo抑制乳腺癌肝转移

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图7A：乳腺癌肝转移模型实验设计。与图4A一致，第24天解剖小鼠，分析肝脏转移情况。

图7B：肝脏组织HE染色。G2组（DOX单独处理）肝脏可见大量转移灶，G5组转移灶数量显著减少，证实Biordee策略抑制化疗诱导的肝转移。

图7C：肝脏转移灶定量。G5组肝脏转移灶数量（约5个/视野）显著低于G2组（约20个/视野）和G4组（约12个/视野）。

图7D：肝脏组织T细胞的免疫荧光。G5组肝脏内CD4⁺T细胞（红色）和CD8⁺T细胞（绿色）浸润密度显著高于其他组，证实免疫应答增强与转移抑制相关。

这些结果表明，Biordee策略可有效阻断TExo构建前转移微环境的作用，抑制化疗诱导的乳腺癌肝转移，且该效应与增强肝脏局部免疫应答相关。

 

结论

本研究成功开发“生物正交反应驱动外泌体清除（Biordee）”策略，通过代谢糖工程使肿瘤细胞分泌携带N₃基团的TExo（TExo-N₃），再经生物正交反应将IgG Fc修饰于TExo-N₃表面形成TExo-Fc，借助IgG Fc与巨噬细胞FcγRII/III受体的相互作用实现循环TExo的高效清除。体外实验证实该修饰过程不破坏TExo基本结构，且能显著促进巨噬细胞吞噬TExo；4T1乳腺癌小鼠模型中，Biordee策略与DOX协同作用，可清除化疗诱导释放的TExo，减少外泌体PD-L1介导的免疫抑制，促进树突状细胞成熟与T细胞活化，减少调节性T细胞和M2型巨噬细胞等免疫抑制细胞浸润，重塑肿瘤免疫微环境，最终抑制肿瘤生长与肝转移并延长小鼠生存期；在PD-L1低表达的231乳腺癌模型中，该策略仍能有效抑制转移，证实普适性。不过，策略的长期毒性（如是否误清除生理必需外泌体）、Man@Lip的靶向递送效率仍需进一步优化，为后续临床转化奠定基础。效率仍需进一步优化，为后续临床转化奠定基础。