外泌体技术三连击：差速离心提取+荧光示踪+通路验证，揭秘铅中毒干预新路径！

人脐带间充质干细胞来源外泌体（hucMSC-exos）因低免疫原性、高生物相容性、可靶向修饰等优势，在再生医学和疾病干预领域展现出良好前景，可用于肺、心血管、肝肾等多种疾病的治疗。然而，目前关于hucMSC-exos干预外源化学物（如铅）致肾损伤的研究较少。

 

今天分享的是一篇发表在【Ecotoxicol Environ Saf】（IF：8.5）上题为“Human umbilical cord mesenchymal stem cell -derived exosomes alleviated the toxic effects induced by lead on HK-2 cells via regulating the unfolded protein response”的研究，该研究旨在探索人脐带间充质干细胞来源外泌体（hucMSC-exos）对铅诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）毒性的保护作用，以及蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）介导的UPR信号通路在该过程中的作用，为铅中毒的防控提供新的干预策略。研究结果证实：（1）铅暴露可激活HK-2细胞中的未折叠蛋白反应（UPR），具体表现为PERK磷酸化水平升高，其分子伴侣BIP及下游信号分子CHOP的表达上调。同时，铅还可诱导HK-2细胞发生显著的DNA损伤、氧化应激和凋亡，且这些毒性效应与铅诱导的UPR密切相关；（2）hucMSC-exos可被HK-2细胞有效摄取，通过下调PERK磷酸化水平及BIP、CHOP的表达，显著缓解铅诱导的UPR，进而减轻铅对HK-2细胞的DNA损伤、氧化应激和凋亡等毒性效应；（3）PERK在铅诱导的HK-2细胞UPR及后续毒性效应中发挥关键作用：使用PERK特异性抑制剂GSK2606414阻断PERK活性后，铅诱导的UPR被抑制，其介导的DNA损伤、氧化应激和凋亡也显著缓解。 

 

研究成果

1. hucMSC-exos的表征及HK-2细胞对hucMSC-exos的摄取

 

图1 hucMSC-exos的表征及HK-2细胞对hucMSC-exos的摄取。

图1A：通过透射电子显微镜（TEM）观察hucMSC-exos的形态特征。结果显示hucMSC-exos呈现双膜结构和圆杯状形态。

图1B-C：通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测hucMSC-exos的粒径分布。结果显示hucMSC-exos的粒径均值为142.0±11.4 nm，同时获得其粒径分布散点图。

图1D：通过激光共聚焦扫描显微镜（CLSMA）观察DAPI标记的HK-2细胞核。结果显示细胞核呈蓝色。

图1E：通过CLSMA观察PKH67荧光染料标记的hucMSC-exos。结果显示hucMSC-exos呈绿色。

图1F：将图1D与图1E的图像合并。结果显示HK-2细胞摄取的hucMSC-exos定位于细胞质中，部分位于核膜表面。

这些结果表明，本研究通过差速梯度超速离心法成功分离出hucMSC-exos，且HK-2细胞能够有效摄取hucMSC-exos。

 

2.铅对HK-2细胞的毒性及hucMSC-exos对铅诱导HK-2细胞UPR的保护作用

 

图2铅对HK-2细胞的毒性及hucMSC-exos对铅诱导HK-2细胞UPR的保护作用。

图2A：采用CCK-8法检测铅（Pb(Ac)₂）暴露24h对HK-2细胞的细胞毒性。结果显示当铅浓度为20、40、80、160、320μM时，细胞均出现显著毒性，计算得24h时铅对HK-2细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为357.7μM，细胞活力随铅浓度升高而降低。

图2B：采用CCK-8法检测铅暴露48h对HK-2细胞的细胞毒性。结果显示各浓度铅均诱导显著细胞毒性，48h时IC₅₀为134.6μM，细胞活力随浓度升高而下降，且相同浓度下毒性较24h更强。

图2C：采用CCK-8法检测铅暴露72h对HK-2细胞的细胞毒性。结果显示各浓度铅均引发显著细胞毒性，72h时IC₅₀为50.68μM，细胞活力随浓度升高和暴露时间延长进一步降低。

图2D：采用qRT-PCR检测各组HK-2细胞中BIP mRNA的表达水平。结果显示与正常HK-2细胞组相比，铅处理组（Pb(Ac)₂组）BIP mRNA表达显著升高，而铅+hucMSC-exos处理组（Pb(Ac)₂+exo组）BIP mRNA表达显著下调。

图2E：采用qRT-PCR检测各组HK-2细胞中PERKmRNA的表达水平。结果显示Pb(Ac)₂组PERK mRNA表达显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组PERK mRNA表达显著低于Pb(Ac)₂组。

图2F：采用qRT-PCR检测各组HK-2细胞中CHOP mRNA的表达水平。结果显示Pb(Ac)₂组CHOP mRNA表达显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组CHOP mRNA表达显著低于Pb(Ac)₂组。

图2G：采用Western blot检测各组HK-2细胞中PERK蛋白的表达水平。结果显示Pb(Ac)₂组与正常组、Pb(Ac)₂+exo组相比，PERK蛋白表达无显著差异。

图2H：采用Western blot检测各组HK-2细胞中p-PERK（磷酸化PERK）蛋白的表达水平。结果显示Pb(Ac)₂组p-PERK蛋白表达显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组p-PERK蛋白表达显著低于Pb(Ac)₂组。

图2I：采用Western blot检测各组HK-2细胞中BIP蛋白的表达水平。结果显示Pb(Ac)₂组BIP蛋白表达显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组BIP蛋白表达显著低于Pb(Ac)₂组。

图2J：采用Western blot检测各组HK-2细胞中CHOP蛋白的表达水平。结果显示Pb(Ac)₂组CHOP蛋白表达显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组CHOP蛋白表达显著低于Pb(Ac)₂组。

图2K：对Western blot结果中p-PERK/PERK比值进行定量分析。结果显示Pb(Ac)₂组p-PERK/PERK比值显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组该比值显著低于Pb(Ac)₂组。

图2L：对Western blot结果中BIP蛋白相对表达量进行定量分析。结果与图2I一致，Pb(Ac)₂组BIP蛋白相对表达量显著升高，Pb(Ac)₂+exo组显著降低。

这些结果表明，铅对HK-2细胞的毒性具有浓度和时间依赖性，48h为适宜暴露时间，40μM为适宜暴露浓度；铅可通过升高BIP、PERK（mRNA水平）、CHOP（mRNA和蛋白水平）及p-PERK蛋白水平、p-PERK/PERK比值诱导HK-2细胞发生UPR，而hucMSC-exos可显著下调上述指标，缓解铅诱导的UPR。

 

3. hucMSC-exos对铅诱导HK-2细胞DNA损伤和氧化损伤的保护作用

 

图3 hucMSC-exos对铅诱导HK-2细胞DNA损伤和氧化损伤的保护作用。

图3A：采用单细胞凝胶电泳（SCGE）检测各组HK-2细胞的DNA损伤情况。结果显示与正常HK-2细胞组相比，Pb(Ac)₂组细胞出现明显的DNA拖尾现象（彗星尾），而Pb(Ac)₂+exo组细胞的DNA拖尾现象显著减轻，H₂O₂组（阳性对照）则出现严重拖尾。

图3B：对SCGE结果中Tail DNA%（尾DNA百分比）进行定量分析。结果显示Pb(Ac)₂组Tail DNA%显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组Tail DNA%显著低于Pb(Ac)₂组，H₂O₂组显著高于正常组。

图3C：对SCGE结果中橄榄尾矩（OTM）进行定量分析。结果显示Pb(Ac)₂组OTM显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组OTM显著低于Pb(Ac)₂组，H₂O₂组显著高于正常组。

图3D：采用试剂盒检测各组HK-2细胞中谷胱甘肽（GSH）含量。结果显示Pb(Ac)₂组GSH含量显著低于正常组，Pb(Ac)₂+exo组GSH含量显著高于Pb(Ac)₂组。

图3E：采用试剂盒检测各组HK-2细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果显示Pb(Ac)₂组SOD活性显著低于正常组，Pb(Ac)₂+exo组SOD活性显著高于Pb(Ac)₂组。

图3F：采用试剂盒检测各组HK-2细胞中丙二醛（MDA）含量。结果显示Pb(Ac)₂组MDA含量显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组MDA含量显著低于Pb(Ac)₂组。

这些结果表明，铅可显著诱导HK-2细胞发生DNA损伤（Tail DNA%和OTM升高）和氧化应激（GSH降低、SOD活性下降、MDA升高），而hucMSC-exos可有效缓解铅诱导的DNA损伤和氧化损伤。

 

4. hucMSC-exos对铅诱导HK-2细胞凋亡的保护作用

 

图4 hucMSC-exos对铅诱导HK-2细胞凋亡的保护作用。

图4A：采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组HK-2细胞的凋亡情况。结果显示正常HK-2细胞组凋亡细胞（Q2+Q4象限）比例较低，Pb(Ac)₂组凋亡细胞比例显著升高，Pb(Ac)₂+exo组凋亡细胞比例显著低于Pb(Ac)₂组。

图4B：对凋亡率进行定量统计。结果显示Pb(Ac)₂组HK-2细胞凋亡率显著高于正常组，Pb(Ac)₂+exo组凋亡率显著低于Pb(Ac)₂组。

这些结果表明，铅可显著诱导HK-2细胞凋亡，而hucMSC-exos可有效抑制铅诱导的HK-2细胞凋亡。

 

5. PERK抑制剂GSK2606414对铅诱导HK-2细胞UPR的影响

 

图5 PERK抑制剂GSK2606414对铅诱导HK-2细胞UPR的影响。

图5A：采用Western blot检测各组HK-2细胞中PERK、p-PERK、BIP、CHOP蛋白的表达水平。

图5B：对Western blot结果中PERK蛋白相对表达量进行定量分析。结果显示各组间PERK蛋白表达无显著差异，表明GSK2606414不影响PERK蛋白的基础表达。

图5C：对Western blot结果中p-PERK蛋白相对表达量进行定量分析。结果显示Pb(Ac)₂组p-PERK蛋白表达显著高于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组p-PERK蛋白表达显著低于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组相比无显著差异或进一步轻微下调。

图5D：对Western blot结果中p-PERK/PERK比值进行定量分析。结果与p-PERK蛋白表达趋势一致，Pb(Ac)₂组p-PERK/PERK比值显著升高，Pb(Ac)₂+GSK组显著降低，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组相近。

图5E：对Western blot结果中BIP蛋白相对表达量进行定量分析。结果显示Pb(Ac)₂组BIP蛋白表达显著高于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组BIP蛋白表达显著低于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组无显著差异或轻微下调。

图5F：对Western blot结果中CHOP蛋白相对表达量进行定量分析。结果显示Pb(Ac)₂组CHOP蛋白表达显著高于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组CHOP蛋白表达显著低于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组无显著差异或轻微下调。

这些结果表明，PERK抑制剂GSK2606414可通过抑制PERK的磷酸化（降低p-PERK蛋白水平和p-PERK/PERK比值），进而下调铅诱导的BIP和CHOP蛋白表达升高，提示PERK在铅诱导HK-2细胞UPR过程中发挥关键作用。

 

6. PERK抑制剂GSK2606414对铅诱导HK-2细胞DNA损伤和氧化应激的缓解作用

图6 PERK抑制剂GSK2606414对铅诱导HK-2细胞DNA损伤和氧化应激的缓解作用。

图6A：采用SCGE检测各组HK-2细胞的DNA损伤情况。结果显示Pb(Ac)₂组细胞DNA拖尾明显，Pb(Ac)₂+GSK组拖尾现象显著减轻，Pb(Ac)₂+GSK+exo组拖尾进一步减轻或与Pb(Ac)₂+GSK组相近，GSK组（单独GSK2606414处理）和H₂O₂组分别表现为无明显拖尾和严重拖尾。

图6B：对SCGE结果中Tail DNA%进行定量分析。结果显示Pb(Ac)₂组Tail DNA%显著高于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组Tail DNA%显著低于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组无显著差异或进一步降低。

图6C：对SCGE结果中OTM进行定量分析。结果显示Pb(Ac)₂组OTM显著高于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组OTM显著低于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组无显著差异或进一步降低。

图6D：采用试剂盒检测各组HK-2细胞中GSH含量。结果显示Pb(Ac)₂组GSH含量显著低于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组GSH含量显著高于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组无显著差异或进一步升高。

图6E：采用试剂盒检测各组HK-2细胞中SOD活性。结果显示Pb(Ac)₂组SOD活性显著低于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组SOD活性显著高于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组无显著差异或进一步升高。

图6F：采用试剂盒检测各组HK-2细胞中MDA含量。结果显示Pb(Ac)₂组MDA含量显著高于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组MDA含量显著低于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组无显著差异或进一步降低。

这些结果表明，抑制PERK活性（通过GSK2606414）可有效缓解铅诱导的HK-2细胞DNA损伤（降低Tail DNA%和OTM）和氧化应激（升高GSH和SOD、降低MDA），进一步证实PERK在铅诱导的HK-2细胞DNA损伤和氧化应激中发挥重要作用。

 

7. PERK抑制剂GSK2606414减轻铅诱导的细胞凋亡

 

图7 PERK抑制剂GSK2606414对铅诱导HK-2细胞凋亡的缓解作用。

图7A：采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组HK-2细胞的凋亡情况。结果显示正常组凋亡细胞比例低，Pb(Ac)₂组凋亡细胞比例显著升高，Pb(Ac)₂+GSK组凋亡细胞比例显著低于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组凋亡细胞比例与Pb(Ac)₂+GSK组相近或进一步降低。

图7B：对凋亡率进行定量统计。结果显示Pb(Ac)₂组HK-2细胞凋亡率显著高于正常组，Pb(Ac)₂+GSK组凋亡率显著低于Pb(Ac)₂组，Pb(Ac)₂+GSK+exo组与Pb(Ac)₂+GSK组无显著差异或进一步降低。

这些结果表明，抑制PERK活性可显著降低铅诱导的HK-2细胞凋亡率，提示PERK是铅诱导HK-2细胞凋亡的关键调控因子之一。

 

结论

如今，外泌体在再生医学、污染物毒性干预、器官损伤修复等领域的研究正不断突破，而hucMSC-exos作为其中的“明星载体”，还藏着更多待探索的机制与应用可能。若您对外泌体科研合作、学术交流或课题设计感兴趣，欢迎联系我们，专业团队可为您提供专业学术支持，共同挖掘外泌体技术应用与转化中的更多价值！