IF：14+，外泌体circPRKD3“断联”IL6ST-STAT3，胶质瘤 TAMs 重编程+ CD8⁺T细胞招募双 buff 拉满！

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性颅内肿瘤，具有高复发率和极差预后，其核心机制与肿瘤干细胞（GSCs）调控的免疫抑制微环境（TME）密切相关。GSCs通过分泌外泌体传递生物活性分子（如非编码RNA），影响肿瘤细胞增殖、干细胞特性维持及免疫细胞功能，但GSCs来源外泌体环状RNA（GDE-circRNAs）在TME重塑中的作用尚不明确。现有研究显示，外泌体circRNAs可作为肿瘤诊断标志物和治疗靶点，但针对GDE-circRNAs调控GBM免疫微环境的机制研究仍属空白。

 

今天分享的是发表在【Neuro Oncol】（IF：13.4）上题为“CircPRKD3-loaded exosomes concomitantly elicit tumor growth inhibition and glioblastoma microenvironment remodeling via inhibiting STAT3 signaling”的研究。该研究通过高通量测序筛选出GDE-circPRKD3，系统验证其在GBM中的表达特征、生物学功能及分子机制，探索其通过调控STAT3信号影响GSCs干性、肿瘤细胞恶性表型及TME中免疫细胞的作用，并开发脑靶向脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，结合免疫检查点阻断（ICB）therapy，为GBM的RNA免疫治疗提供新策略。

 

研究结果

1.GSCs来源外泌体circPRKD3低表达且为潜在生物标志物，与TME调控相关

 

图1A：流式细胞术检测GSCs表面标志物CD133表达。U87-GSLC（U87来源胶质瘤干细胞样细胞）及原代GSC-3/4/5/13的CD133阳性率显著高于对应原代非干细胞胶质瘤细胞（G-3/4/5/13），证实GSCs成功分离。

图1B：RNA-seq差异circRNA分析热图。GSCs来源外泌体与正常外泌体（人星形胶质细胞/神经祖细胞来源）相比，共筛选出617个差异circRNAs，circPRKD3为下调最显著的circRNA之一。

图1C：circPRKD3基因结构与验证。circPRKD3由PRKD3基因第2外显子反向剪接形成，发散引物PCR可扩增出circPRKD3特异性条带，Sanger测序证实其反向剪接位点。

图1D：RNase R酶切实验。GSC-5细胞中，circPRKD3经RNase R处理后相对表达量无显著下降，证实其环状结构稳定性。

图1E：RT-qPCR检测circPRKD3在GSCs外泌体中的表达：GSCs来源外泌体中circPRKD3表达显著低于正常外泌体，与RNA-seq结果一致。

图1F：circPRKD3在临床样本中的表达。34例正常脑组织（NBTs）与175例胶质瘤组织中，circPRKD3表达随胶质瘤病理分级升高而降低，GBM组织中表达最低。

图1G：RNA原位杂交（FISH）。circPRKD3主要定位于胶质瘤细胞胞质，细胞核中几乎无信号，证实其胞质定位特征。

图1H：GBM患者生存分析。64例GBM患者中，circPRKD3高表达组中位生存期显著长于低表达组，提示circPRKD3高表达与良好预后相关。

图1I：免疫荧光检测CD86⁺巨噬细胞浸润。circPRKD3高表达的GBM组织中，CD86⁺促炎型巨噬细胞比例显著高于低表达组，证实circPRKD3与TME中促炎免疫细胞浸润正相关。

图1J：血浆外泌体circPRKD3表达：81例GBM患者血浆外泌体中circPRKD3表达显著低于70例健康对照，ROC曲线显示其区分GBM与健康人的AUC=0.9286，区分高/低级别胶质瘤的AUC=0.8977，证实其诊断价值。

这些结果表明，GSCs来源外泌体circPRKD3呈低表达特征，可作为GBM诊断与预后评估的潜在生物标志物，且其表达水平与TME中促炎巨噬细胞浸润相关，提示其可能参与GBM免疫微环境调控。

 

2.GDE-circPRKD3抑制GBM进展

 

图2A：慢病毒过表达circPRKD3验证。在GSC-4、GSC-5中稳定过表达circPRKD3后，其来源外泌体中circPRKD3表达显著升高，证实外泌体可携带过表达的circPRKD3。

图2B：外泌体介导circPRKD3传递。U87、G-17细胞与GDE-OE-circPRKD3共孵育后，细胞内circPRKD3表达显著升高，而其亲本基因PRKD3表达无变化，证实外泌体可特异性传递circPRKD3。

图2C-D：EdU增殖实验。U87、G-17细胞经GDE-OE-circPRKD3处理后，EdU阳性细胞比例显著降低，证实GDE-circPRKD3抑制胶质瘤细胞增殖。

图2E：Transwell侵袭实验。GDE-OE-circPRKD3处理组U87、G-17细胞侵袭能力显著下降，证实其抑制肿瘤细胞侵袭。

图2F：体内实验设计。BALB/c裸鼠颅内接种G-17细胞，通过眶后注射给予PBS、对照外泌体或GDE-OE-circPRKD3，结合IVIS活体成像监测肿瘤生长。

图2G-H：活体成像定量。GDE-OE-circPRKD3组小鼠颅内肿瘤荧光强度显著低于对照外泌体组和PBS组，证实其抑制体内肿瘤生长。

图2I：生存分析。GDE-OE-circPRKD3组小鼠中位生存期显著长于对照外泌体组和PBS组，证实其改善荷瘤小鼠预后。

图2J：HE染色。GDE-OE-circPRKD3组肿瘤组织坏死区域更大，肿瘤边界更清晰，而对照组肿瘤组织致密、坏死少，证实其促进肿瘤细胞坏死。

图2K：免疫组化（IHC）检测p-STAT3。GDE-OE-circPRKD3组肿瘤组织中p-STAT3阳性细胞比例显著低于对照外泌体组，证实其抑制STAT3信号激活。

这些结果表明，GDE-circPRKD3可通过外泌体传递至胶质瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖与侵袭，减少体内肿瘤生长并延长荷瘤小鼠生存期，且其作用与抑制STAT3信号激活相关。

 

3.GDE-circPRKD3通过HNRNPC/IL6ST/STAT3轴调控IL6STmRNA稳定性，抑制GBM进展

 

图3A：RNA-seq差异基因韦恩图。GDE-OE-circPRKD3与GDE-KD-circPRKD3处理胶质瘤细胞后，共筛选出3个共同差异基因，其中IL6ST表达变化最显著。

图3B：RT-qPCR验证IL6ST表达。G-17细胞经GDE-OE-circPRKD3处理后，IL6ST mRNA表达显著降低，而NEURL3、FOS等基因无显著变化，证实IL6ST为circPRKD3的关键靶基因。

图3C：rescue实验验证。G-17细胞过表达IL6ST后，GDE-OE-circPRKD3对IL6ST的抑制作用被逆转，证实circPRKD3直接调控IL6ST。

图3D：Western blot检测IL6ST/STAT3通路。GDE-OE-circPRKD3处理组IL6ST、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达显著降低，而过表达IL6ST可恢复p-JAK2、p-STAT3水平，证实circPRKD3通过抑制IL6ST阻断JAK/STAT3通路。

图3E：RNA pulldown银染。用circPRKD3特异性探针捕获其结合蛋白，银染显示约55kDa处存在特异性条带，质谱鉴定为RNA结合蛋白HNRNPC。

图3F：RIP实验验证circPRKD3与HNRNPC结合。抗HNRNPC抗体免疫沉淀后，circPRKD3富集效率显著高于抗HNRNPA2B1、AUF1等抗体，GAPDH无富集，证实HNRNPC特异性结合circPRKD3。

图3G：HNRNPC截短体设计。构建全长HNRNPC（FL）、缺失26-77aa的截短体（Del1）、缺失176-232aa的截短体（Del2），其中176-232aa包含RNA识别基序（RRM）。

图3H：RIP验证HNRNPC结合结构域。Del2截短体与circPRKD3的结合效率显著低于FL和Del1，证实HNRNPC通过176-232aa结构域结合circPRKD3。

图3I：HNRNPC调控IL6ST mRNA稳定性。LN229细胞敲低HNRNPC后，经放线jun素D处理（抑制转录），IL6ST mRNA半衰期从约12h缩短至4h，证实HNRNPC维持IL6ST mRNA稳定。

图3J：GDE-circPRKD3抑制IL6ST mRNA稳定性：G-17细胞经GDE-OE-circPRKD3处理后，IL6ST mRNA半衰期从约10h缩短至6h，证实circPRKD3加速IL6ST mRNA降解。

图3K：GDE-circPRKD3竞争性结合HNRNPC：GDE-OE-circPRKD3处理组中，HNRNPC与IL6ST的结合效率显著低于对照组，证实circPRKD3竞争性抑制HNRNPC与IL6ST结合。

图3L：m⁶A修饰影响结合。circPRKD3的m⁶A突变体（m⁶A-Mut）与HNRNPC的结合效率显著低于野生型，且其对HNRNPC-IL6ST结合的抑制作用减弱，证实circPRKD3以m⁶A依赖方式结合HNRNPC。

这些结果表明，GDE-circPRKD3通过m⁶A依赖方式结合HNRNPC，竞争性抑制HNRNPC与IL6ST mRNA的结合，加速IL6ST mRNA降解，进而阻断JAK/STAT3通路，抑制GBM进展。

 

4.GDE-circPRKD3通过CXCL10促进CD8⁺T细胞浸润

图4A：小鼠GBM模型实验设计。C57BL/6J小鼠颅内接种GL261-luci细胞，眶后注射PBS、对照外泌体或mGDE-OE-circPrkd3，每 3 天1次，IVIS监测肿瘤生长。

图4B：活体成像定量。mGDE-OE-circPrkd3组小鼠肿瘤荧光强度显著低于对照外泌体组和PBS组，证实小鼠源GDE-circPrkd3同样抑制肿瘤生长。

图4C：生存分析。mGDE-OE-circPrkd3组小鼠中位生存期显著长于对照外泌体组和PBS组，证实其体内治疗效果。

图4D：t-SNE分析肿瘤浸润免疫细胞。mGDE-OE-circPrkd3组CD45⁺免疫细胞中，CD8⁺T细胞、NK细胞聚类显著增多，而Treg细胞、M2型巨噬细胞聚类减少，证实其重塑TME免疫细胞组成。

图4E：流式细胞术定量。mGDE-OE-circPrkd3组CD8⁺T细胞、NK细胞占CD45⁺细胞比例显著高于对照组，CD4⁺T细胞、巨噬细胞比例无显著变化。

图4F：免疫荧光检测CD8⁺T细胞。mGDE-OE-circPrkd3组肿瘤组织中CD8⁺T细胞浸润密度显著高于对照组，证实其促进CD8⁺T细胞肿瘤内浸润。

图4G：流式检测CD8⁺T细胞功能。mGDE-OE-circPrkd3组GranzymeB⁺（GzB⁺）CD8⁺T细胞比例显著高于对照组，证实其增强CD8⁺T细胞细胞毒性。

图4H：ELISA检测CXCL10。mGDE-OE-circPrkd3组小鼠血清CXCL10浓度显著高于对照组，证实其促进CXCL10分泌。

图4I：免疫荧光共定位。mGDE-OE-circPrkd3组肿瘤组织中，CXCL10（绿色）与F4/80⁺巨噬细胞（红色）共定位信号显著增强，证实CXCL10主要由TAMs分泌。

图4J：RT-qPCR检测CXCL10来源。从小鼠肿瘤中分离的单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs）中，CXCL10 mRNA表达显著升高，而小胶质细胞（MG）中无显著变化，证实MDMs是CXCL10的主要来源。

图4K：CXCR3阻断实验。抗CXCR3抗体处理后，mGDE-OE-circPrkd3组肿瘤荧光强度显著高于单独处理组，小鼠生存期从约60天缩短至40天，证实CXCL10-CXCR3轴对治疗效果至关重要。

图4L：CXCR3阻断对CD8⁺T细胞的影响。抗CXCR3抗体处理后，mGDE-OE-circPrkd3组CD8⁺T细胞浸润比例显著低于单独处理组，但剩余CD8⁺T细胞的GzB分泌能力无显著变化，证实CXCL10主要调控CD8⁺T细胞招募而非活化。

这些结果表明，GDE-circPRKD3通过促进TAMs分泌CXCL10，经CXCL10-CXCR3轴招募CD8⁺T细胞浸润至肿瘤微环境，增强CD8⁺T细胞细胞毒性，进而发挥antitumor免疫效应。

 

5.GDE-circPRKD3重编程肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向M1型极化

 

图5A：巨噬细胞耗竭实验设计。C57BL/6J小鼠颅内接种GL261-luci细胞，口服CSF1R抑制剂PLX3397耗竭巨噬细胞，同时眶后注射mGDE-OE-circPrkd3，IVIS监测肿瘤生长。

图5B：生存分析：PLX3397处理后，mGDE-OE-circPrkd3组小鼠中位生存期显著短于单独mGDE-OE-circPrkd3组，证实巨噬细胞是GDE-circPRKD3发挥作用的关键细胞。

图5C：流式检测CD8⁺T细胞。PLX3397联合mGDE-OE-circPrkd3组CD8⁺T细胞比例显著低于单独mGDE-OE-circPrkd3组，证实巨噬细胞耗竭削弱CD8⁺T细胞浸润。

图5D：流式检测TAMs表型。mGDE-OE-circPrkd3组CD86⁺M1型巨噬细胞比例显著高于对照外泌体组，证实其促进TAMs向M1型极化。

图5E：TAMs与CD8⁺T细胞共培养。mGDE-OE-circPrkd3组TAMs（MDMs）与CFSE标记的活化CD8⁺T细胞共培养后，CD8⁺T细胞增殖比例显著高于对照组，证实重编程后的TAMs促进T细胞增殖。

图5F：M2型BMDMs极化检测。mGDE-OE-circPrkd3处理IL-4/IL-13诱导的M2型骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）后，CD86⁺细胞比例显著高于对照组，证实其诱导M2型巨噬细胞向M1型转化。

图5G：RT-qPCR检测M1标志物。mGDE-OE-circPrkd3组M2型BMDMs中Il-1α、Tnf-α、Il-1β等M1型基因表达显著上调，M2型基因表达显著下调。

图5H：Western blot检测M1/M2标志物。mGDE-OE-circPrkd3组M2型BMDMs中iNOS蛋白表达升高，IL-10、ARG1蛋白表达降低，证实其调控巨噬细胞极化相关蛋白。

图5I：M2型BMDMs与CD8⁺T细胞共培养。mGDE-OE-circPrkd3处理的M2型BMDMs与CD8⁺T细胞共培养后，CD8⁺T细胞增殖比例显著高于对照组，证实其逆转M2型巨噬细胞对T细胞的抑制作用。

图5J：RT-qPCR检测共培养体系中巨噬细胞表型。GL261细胞诱导的M2型BMDMs经mGDE-OE-circPrkd3处理后，Cd86、Il-1β等M1基因表达上调，Chil3、Mrc1等M2基因表达下调，证实其在肿瘤细胞诱导的巨噬细胞极化中仍发挥作用。

图5K：Western blot验证。上述共培养体系中，mGDE-OE-circPrkd3组CD86蛋白表达升高，IL-10、ARG1蛋白表达降低，与RT-qPCR结果一致。

图5L：Western blot检测信号通路。mGDE-OE-circPrkd3组M2型BMDMs中p-STAT1、p-P65（NF-κB）蛋白表达显著升高，p-STAT3蛋白表达显著降低，证实其通过激活STAT1/NF-κB、抑制STAT3通路调控巨噬细胞极化。

这些结果表明，GDE-circPRKD3通过激活STAT1/NF-κB通路、抑制STAT3通路，重编程TAMs从M2型免疫抑制表型向M1型促炎表型转化，进而促进CD8⁺T细胞增殖与功能，增强antitumor免疫。

 

6.LNP递送circPRKD3联合PD-1阻断治疗延长GBM小鼠生存期

图6A：脑靶向LNP表征。冷冻电镜显示Ang-2修饰的LNP呈球形，粒径均一，可有效包裹circPRKD3。

图6B：LNP转染效率。GL261细胞与Cy5标记的Ang-2-LNP-circPrkd3共孵育后，circPrkd3表达显著升高（约3倍），证实LNP可高效递送circPRKD3至肿瘤细胞。

图6C：体内治疗方案。C57BL/6J小鼠颅内接种GL261-luci细胞，鼻腔滴注Ang-2-LNP-circPrkd3，同时腹腔注射抗PD-1抗体，监测肿瘤生长与生存。

图6D：活体成像。LNP-circPrkd3+抗PD-1组小鼠肿瘤荧光强度显著低于LNP-NC组、单独抗PD-1组和单独LNP-circPrkd3组，证实联合治疗抑制肿瘤生长效果最优。

图6E：荧光强度定量。联合治疗组肿瘤荧光强度随时间增长最慢，第35天较其他组降低约70%-80%，证实其持续抑制肿瘤进展。

图6F：生存分析。LNP-circPrkd3+抗PD-1组小鼠中位生存期显著长于单独LNP-circPrkd3组、单独抗PD-1组和LNP-NC组，证实联合治疗协同延长生存期。

图6G：LNP体内分布。Cy5标记的Ang-2-LNP主要富集于小鼠脑肿瘤组织和肝脏，脑内荧光强度显著高于非靶向LNP，证实其脑靶向递送能力。

图6H-I：流式检测免疫细胞。联合治疗组CD8⁺T细胞、NK细胞、CD86⁺M1型巨噬细胞比例显著高于其他组，CD206⁺M2型巨噬细胞比例显著降低，证实其最优重塑TME免疫组成。

图6J-K：免疫荧光检测CD8⁺T细胞。联合治疗组肿瘤组织中CD8⁺T细胞浸润密度显著高于其他组，证实其最强促进CD8⁺T细胞浸润。

图6L：ELISA检测细胞因子。联合治疗组小鼠血清CXCL10、TNF-α、IFN-γ浓度显著高于其他组，证实其最强激活炎症免疫应答。

这些结果表明，脑靶向Ang-2-LNP可高效递送circPRKD3至GBM组织，联合抗PD-1免疫检查点阻断治疗可协同重塑免疫微环境、增强CD8⁺T细胞浸润与功能，显著延长荷瘤小鼠生存期，为GBM的RNA免疫治疗提供可行方案。

 

结论

本研究首次揭示胶质瘤干细胞来源外泌体circPRKD3在GBM中的关键作用：circPRKD3在GSCs外泌体中低表达，可作为GBM诊断与预后的潜在生物标志物；其通过m⁶A依赖方式结合HNRNPC，竞争性抑制HNRNPC与IL6ST mRNA的结合并加速其降解，进而阻断JAK/STAT3通路，抑制GSCs干性维持、肿瘤细胞增殖与侵袭；同时，circPRKD3可重编程TAMs向M1型极化，促进TAMs分泌CXCL10，经CXCL10-CXCR3轴招募CD8⁺T细胞浸润并增强其细胞毒性；此外，脑靶向Ang-2-LNP递送circPRKD3联合抗PD-1治疗可协同抑制GBM生长、延长荷瘤小鼠生存期。该研究不仅阐明了GDE-circPRKD3调控GBM进展与免疫微环境的分子机制，还为GBM的RNA免疫治疗提供了新的靶点与策略，具有重要的临床转化价值。