“双功能工程外泌体”体内修复效能！“转录组PCA+GSEA分析”深挖分子机制

WNT信号通路是调节组织形态发生和再生的重要途径。然而，由于缺乏识别和向目标组织递送特定WNT配体的方法，将其用于再生医学一直颇具挑战性。以下研究提出的“双功能工程外泌体（exoWNT3A/RSPO1）”，为这一难题提供了突破性解决方案——其通过WLS蛋白介导，实现WNT3A与RSPO1双配体高效共载，在急性肝损伤、慢性肝纤维化及衰老肝脏模型中均展现出优异修复效能，并通过“转录组PCA+GSEA分析”解锁外泌体调控肝再生的分子密码。

今天分享的是一篇发表在【Nat Commun.】（IF：15.7）上题为“Dual-ligand engineered exosome regulates WNT signaling activation to promote liver repair and regeneration”的研究，该研究开发了一组携带19种WNT和4种RSPO配体的工程化外泌体，这些外泌体即使在存在WNT拮抗剂的情况下也表现出与重组蛋白相当的活性。且将携带WNT和RSPO1的外泌体组合使用时，WNT信号通路会协同激活。研究通过人类肝祖细胞培养，发现WNT3-RSPO1或WNT3A-RSPO1组合能够调节肝祖细胞的命运，部分是通过PPARα信号通路介导的。重要的是，研究结果证明了单个外泌体携带的双WNT3A/RSPO1配体（exoWNT3A/RSPO1）在Axin2-mGFP小鼠模型中能有效诱导WNT活性，能从急性及慢性肝损伤中拯救小鼠，并逆转与衰老相关的肝脏表型。这种激活WNT信号通路的外泌体平台为评估各种生物系统中的WNT配体活性提供了机会，并为受损、患病和衰老组织的再生提供了一种有前景的策略。

 

研究成果

1. WNT和R-spondin家族配体可被工程化到外泌体上

图1A：检测工程细胞系来源的大细胞外囊泡（EV）和外泌体中WLS（Wnt转运蛋白）与WNT3A的蛋白水平。结果显示外泌体中WLS和WNT3A的富集程度高于大EV。

图1B：定量分析每个外泌体颗粒中WNT3A分子的数量，明确WNT3A在外泌体上的负载效率。

图1C：通过透射电镜（TEM）观察，抗WNT3A抗体标记的金颗粒定位于外泌体表面。结果证实WNT3A可加载到外泌体表面。

图1D：用相同颗粒数的exoWNT3A（无WLS工程化）、exoWLS（仅WLS工程化）和exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ（WLS+WNT3A工程化）处理HEK293FT细胞。TOPFlash报告基因检测显示exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ诱导的WNT信号活性显著高于前两者。

图1E：用相同蛋白量的人重组WNT3A（hrWNT3A）和exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ处理细胞。TOPFlash检测显示两者诱导的WNT信号活性相当，证明外泌体负载的WNT3A功能完整。

图1F：左侧为WNT信号拮抗剂（DKK1、WIF1等）与通路组件相互作用的示意图；右侧为TOPFlash检测。结果证实外泌体可保护WNT配体免受多数拮抗剂干扰。

图1G：通过Western blot检测15种WNT配体在工程外泌体上的表达。结果证实WLS可介导多种WNT配体加载到外泌体。

图1H：检测His标签RSPO1表达细胞的细胞裂解液、条件培养基、大EV和外泌体中RSPO1的水平。结果显示RSPO1可自然富集到外泌体和大EV中，且外泌体中含量显著。

图1I：通过TEM检测。结果显示，抗RSPO1抗体标记的金颗粒定位于外泌体表面，证实RSPO1可加载到外泌体表面。

图1J：相同颗粒数的exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ、exoRSPO1单独或联合处理细胞。TOPFlash检测显示联合处理组信号活性显著高于单独处理组，证明两者协同激活WNT信号。

图1K：Western blot检测。结果显示，exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ+exoRSPO1联合处理组的活性β-连环蛋白（Ser45去磷酸化）和总β-连环蛋白水平高于单独处理组，进一步证实协同激活效应。

图1L：qPCR检测。结果显示，联合处理组的WNT下游靶基因AXIN2和CCND1表达水平显著高于单独处理组，从基因层面验证协同效应。

这些结果表明，WLS可作为通用载体将所有19种WNT配体高效加载到外泌体，且外泌体可保护WNT配体免受多数拮抗剂干扰；RSPO1可自然富集到外泌体，且exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ与exoRSPO1协同激活WNT信号通路。

 

2. exoWNTWLS和exoRSPO1在体外协同调节肝祖细胞命运

图2A：明场图像。结果显示，iPSC来源的肝内胚层（HE）细胞经exoWNT3ᴵᵂᴸˢ+exoRSPO1或exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ+exoRSPO1处理6天后，细胞形态显著变大，呈现肝祖细胞（LPC）特征；而exoWT、exoWNT3ᴵᵂᴸˢ、exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ或exoRSPO1单独处理组无此变化。

图2B：qPCR检测。结果证实联合处理可诱导HE细胞向肝祖细胞分化。

图2C：免疫荧光染色。结果显示，联合处理组的AFP、ALB、HNF4α阳性细胞比例显著高于单独处理组。

图2D：转录组主成分分析（PCA）。结果显示，联合处理组细胞与其他组细胞的转录组差异显著。

图2E：热图显示。结果表明联合处理组中WNT信号相关基因（AXIN2、LGR5等）和肝母细胞标记基因（AFP、ALB等）的表达水平显著上调。

图2F：KEGG通路分析。结果显示，exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ+exoRSPO1处理组上调基因显著富集于WNT信号通路、PPAR信号通路、补体凝血级联等通路。

图2G：免疫荧光染色。结果显示，用PPARα抑制剂GW6471处理后，联合处理组的ALB阳性细胞比例显著降低；而PPARβ/δ抑制剂GSK3787无显著影响。

这些结果表明，exoWNT（WNT3或WNT3A）与exoRSPO1在体外协同调控肝内胚层细胞向肝祖细胞分化，且该过程依赖PPARα信号通路，为体外肝祖细胞诱导提供了高效方法。

 

3.携带WNT3A和RSPO1的双外泌体，有效诱导WNT信号活性，调控肝细胞命运

图3A：示意图展示双配体外泌体（exoWNT3A/RSPO1）的构建原理，即通过工程细胞共表达WLS、WNT3A和RSPO1，使外泌体同时负载两种配体。

图3B：Western blot检测。结果显示，exoWNT3A/RSPO1中WNT3A和RSPO1的蛋白水平分别与exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ、exoRSPO1相当。

图3C：STORM超分辨成像。结果显示，exoWNT3A/RSPO1表面同时存在WNT3A、RSPO1和外泌体标志物CD31。

图3D：免疫金标记TEM。结果显示，抗WNT3A金颗粒和抗RSPO1金颗粒共定位于同一外泌体表面。

图3E：TOPFlash检测，结果显示，相同颗粒数的exoWNT3A/RSPO1诱导的WNT信号活性显著高于exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ+exoRSPO1联合处理组，且与3μMCHIR99021（常用WNT激活剂）相当。

图3F：明场图像和免疫荧光染色。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理6天后，HE细胞呈现肝祖细胞形态，且AFP、ALB、HNF4α阳性细胞比例与联合处理组、CHIR99021处理组相当。

图3G：qPCR检测。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组的LGR5、MYC、AFP、ALB、HNF4α表达水平与联合处理组、CHIR99021处理组无显著差异。

图3H：明场图像。结果显示，用exoWNT3A/RSPO1培养10天的肝类器官体积显著大于exoWT处理组，且略大于CHIR99021处理组。

图3I：qPCR检测。结果显示，exoWNT3A/RSPO1和CHIR99021处理组的LGR5、AXIN2表达水平相当，且均显著高于exoWT组。

图3J：转录组PCA检测。结果显示，exoWNT3A/RSPO1和CHIR99021处理组的肝类器官转录组差异显著。

图3K：韦恩图显示。结果表明exoWNT3A/RSPO1vsexoWT的差异表达基因（DEGs）与CHIR99021 vs exoWT的DEGs存在部分重叠，但也有大量特异性DEGs。

图3L：GSEA分析。结果显示，exoWNT3A/RSPO1特异性DEGs显著富集于RAS-MAPK信号通路和细胞周期通路，而CHIR99021特异性DEGs富集于化学致癌、胆汁分泌等通路。

图3M：明场图像。结果显示，加入RAS-MAPK抑制剂（SB203580或PAN-RAS-IN-1）后，exoWNT3A/RSPO1促进肝类器官生长的效应显著减弱。

这些结果表明，双配体外泌体exoWNT3A/RSPO1可同时高效负载WNT3A和RSPO1，其激活WNT信号的效率高于单配体外泌体联合处理，且通过RAS-MAPK信号通路促进肝类器官生长，功能与小分子抑制剂CHIR99021相当但机制不同。

 

4. exoWNT3A/RSPO1处理小鼠肝脏中WNT信号通路的高效递送和激活

图4A：DiR荧光标记图像。结果显示，静脉注射exoWNT3A/RSPO124小时后，荧光信号主要集中在肝脏，其他器官（脾、肺、心、肾）信号微弱。

图4B：PKH26荧光标记的组织切片，结果显示，外泌体在肝脏中分布广泛，而在脾、肺、心、肾中仅少量分布。

图4C：免疫荧光共定位。结果显示，PKH26标记的外泌体可被肝脏多种细胞摄取。

图4D：左侧为Axin2-mGFP报告小鼠肝脏中央静脉（CV）处的荧光图像，右侧为实验设计示意图。

图4E：免疫荧光图像。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组的Axin2-mGFP信号（WNT活性标志物）在中央静脉周围显著增强，且与区3标记GS（谷氨酰胺合成酶）共定位；exoWT、exoWNT3Aᴵᵂᴸˢ、exoRSPO1处理组信号较弱。

图4F：定量分析。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组的mGFP阳性区域和GS阳性区域百分比显著高于其他组。

这些结果表明，exoWNT3A/RSPO1静脉注射后可快速靶向积累于小鼠肝脏，并被多种肝细胞摄取，特异性激活中央静脉周围细胞的WNT信号；长期给药（1-3个月）无显著器官毒性，仅6个月时小肠出现轻微变化，安全性良好。

 

5. exoWNT3A/RSPO1加速急性损伤后小鼠肝脏修复和再生

图5A：实验设计示意图。

图5B：明场图像。结果显示，APAP损伤组肝脏表面出现坏死灶，exoWNT3A/RSPO1处理组坏死灶显著减少；HE染色显示，APAP损伤组存在大片肝细胞坏死，exoWNT3A/RSPO1处理组坏死区域显著缩小，exoWT处理组无明显改善。

图5C：血清生化检测。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组的ALT（谷丙转氨酶）和AST（谷草转氨酶）水平显著低于APAP损伤组和exoWT处理组。

图5D：免疫荧光检测图像。结果显示，APAP损伤组的GS（区3）、CYP2E1（区2/3）和HNF4α（肝细胞标志物）阳性细胞显著减少，exoWNT3A/RSPO1处理组上述标志物阳性细胞恢复至接近健康组水平。

图5E：热图显示。结果表明exoWNT3A/RSPO1处理组的肝功能相关基因（如Gcdh、Faah）表达上调，炎症和细胞死亡相关基因表达下调。

图5F：实验设计示意图。

图5G：TUNEL染色图像。结果显示，APAP损伤组1-3天均存在大量凋亡细胞，exoWNT3A/RSPO1处理组24小时和48小时后凋亡细胞显著减少。

图5H：定量检测结果。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组的TUNEL+细胞比例显著低于APAP损伤组。

图5I：Ki67免疫荧光检测图像。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组2-3天的Ki67+细胞（增殖标志物）显著多于APAP损伤组和exoWT处理组。

图5J：exoWNT3A/RSPO1处理组的Ki67+细胞比例定量结果。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组Ki67+细胞比例显著高于其他组。

图5K：免疫荧光图像。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理的原代人肝细胞（PHH）中Ki67+细胞比例显著高于exoWT处理组。

图5L：exoWNT3A/RSPO1处理组1天和5天的Ki67+细胞比例定量。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组约为exoWT组的2倍。

这些结果表明，exoWNT3A/RSPO1可通过促进肝细胞增殖、抑制凋亡，显著修复APAP或CCl₄诱导的急性肝损伤，降低血清肝酶水平，恢复肝脏分区，且对原代人肝细胞具有同样的促增殖效应，为急性肝损伤治疗提供依据。

 

6. exoWNT3A/RSPO1在慢性肝损伤后和衰老的小鼠肝脏中修复和恢复肝功能和生理机能

图6A：实验设计示意图。

图6B：整体肝脏图像。结果显示，CCl₄损伤组肝脏表面粗糙、呈颗粒状，exoWNT3A/RSPO1处理组表面光滑度显著改善；Masson和天狼星红染色显示，CCl₄损伤组存在大量胶原沉积，exoWNT3A/RSPO1处理组胶原沉积显著减少。

图6C：exoWNT3A/RSPO1处理组的Masson和天狼星红阳性纤维化区域百分比定量。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组纤维化区域显著低于CCl₄损伤组和exoWT处理组。

图6D：血清生化检测。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组的ALT和AST水平显著低于CCl₄损伤组。

图6E：免疫荧光检测图像。结果显示，CCl₄损伤组的GS、CYP2E1和HNF4α阳性细胞显著减少，exoWNT3A/RSPO1处理组上述标志物阳性细胞恢复。

图6F：exoWNT3A/RSPO1处理组热图。结果显示，肝功能基因（如A1AT）上调，纤维化、炎症和细胞死亡相关基因下调。

图6G：衰老逆转效果实验设计示意图。

图6H：HE染色图像。结果显示，衰老小鼠肝脏肝细胞大小不均，exoWNT3A/RSPO1处理组细胞形态更接近年轻小鼠；β-半乳糖苷酶染色显示，衰老小鼠肝脏存在大量阳性细胞（衰老标志物），exoWNT3A/RSPO1处理组阳性细胞显著减少。

图6I：免疫荧光检测图像。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理组的Ki67+细胞比例显著高于衰老对照组，p21+细胞（衰老相关基因）比例显著低于对照组。

图6J：转录组PCA图像。结果显示，exoWNT3A/RSPO1处理的衰老肝脏转录组与年轻肝脏的距离显著拉近，与衰老对照组差异显著。

图6K：exoWNT3A/RSPO1处理组热图。结果显示，肝功能相关基因（如碳代谢、药物代谢基因）上调，衰老相关基因下调。

这些结果表明，exoWNT3A/RSPO1可减少CCl₄诱导的慢性肝损伤小鼠的胶原沉积和纤维化，恢复肝功能；同时可逆转衰老小鼠肝脏的多倍体肝细胞增加、衰老标志物阳性等表型，使衰老肝脏的转录组和生理功能更接近年轻肝脏，为慢性肝损伤和肝脏衰老的治疗提供新策略。

 

结论

从WLS蛋白介导19种WNT配体高效加载，到exoWNT3A/RSPO1双功能外泌体在急性肝损伤、慢性纤维化与衰老肝脏中展现的“全场景”修复效能，这项研究不仅破解了WNT信号靶向递送的经典难题，更用“转录组PCA+GSEA”等生信工具清晰勾勒出其调控肝再生的分子通路。