谁懂胰腺病变的痛？TSPAN4 +成纤维细胞“联动”迁移体搞破坏，靶定这俩信号轴就是新出路！

该研究聚焦胰腺癌复杂肿瘤微环境（TME）中转移微环境形成的机制缺口，以“迁移体​介导的细胞间通讯”为核心，采用“多组学解析+功能验证”的研究思路突破：首先整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组数据及TCGA/GEO数据库，结合Seurat、Monocle等工具解析胰腺癌组织中TSPAN4⁺成纤维细胞的分布与功能特征；其次通过CellCall/CellChat分析细胞间通讯网络，明确TSPAN4⁺成纤维细胞与免疫细胞、内皮细胞的互作通路；再借助空间代谢组学揭示其对TME代谢重编程的调控作用；最后通过siRNA干扰TSPAN4表达，在胰腺癌细胞系（SW1990、PANC-1）中验证其对细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响，最终明确TSPAN4⁺成纤维细胞通过迁移体驱动代谢重编程与基质-免疫互作，成为胰腺癌转移微环境组装的关键协调者，为胰腺癌治疗提供新靶点。

 

研究背景

胰腺癌（PC）是恶性程度极高的胰腺恶性肿瘤，其复杂的肿瘤微环境（TME）与强转移能力导致预后极差。成纤维细胞作为TME的核心组分，通过重塑细胞外基质（ECM）、调控免疫反应参与肿瘤进展与转移，但具体调控机制尚未完全阐明。

迁移体作为新型细胞外囊泡，直径0.5-3μm，通过细胞迁移时的回缩纤维释放，可携带信号分子介导细胞间通讯，已在肿瘤转移中发挥作用。TSPAN4作为迁移体形成的关键调控因子，可调节细胞黏附与信号传导，ITGA5则参与ECM锚定与迁移编程，二者在胰腺癌成纤维细胞中的作用及对转移微环境的影响尚未明确。此外，胰腺癌免疫治疗疗效受TME免疫抑制微环境限制，探索成纤维细胞对免疫抑制的调控机制，对改善免疫治疗效果具有重要意义。

 

研究结果

1、研究技术路线图

呈现研究的整体技术流程，包括数据获取（GEO单细胞转录组、空间转录组及TCGA胰腺癌数据）、数据处理（批次校正、质量控制）、分析环节（单细胞聚类、拟时序分析、细胞通讯分析、空间转录组解析）及实验验证（qPCR、CCK-8、克隆形成、划痕实验、Transwell侵袭实验、流式细胞术），清晰展示了从多组学解析到功能验证的完整研究框架。这些结果表明，该研究通过系统的多组学分析与实验验证相结合的策略，为解析TSPAN4⁺成纤维细胞在胰腺癌中的作用提供了严谨的技术支撑。

 

2、胰腺癌单细胞水平细胞分型与TSPAN4/ITGA5表达特征

通过t-SNE聚类将胰腺癌组织分为11种主要细胞类型；热图与小提琴图显示，成纤维细胞中转移相关基因模块激活评分最高，且TSPAN4、ITGA5在成纤维细胞中特异性高表达；t-SNE与UMAP投影显示，MC/PC组成纤维细胞与血管内皮细胞功能活性显著高于CT组，且TSPAN4在成纤维细胞区与导管界面特异性分布，ITGA5呈泛基质/内皮分布。这些结果表明，胰腺癌中TSPAN4⁺成纤维细胞富集于转移相关表型，且TSPAN4与ITGA5的差异化表达提示二者在TME中发挥互补作用，可能共同调控肿瘤转移。

 

3、成纤维细胞拟时序轨迹与细胞通讯网络分析

通过拟时序分析显示，TSPAN4、ITGA5在成纤维细胞恶性转化早期高表达，且随拟时序进展成纤维细胞表型逐渐多样化；UMAP分析发现，从CT到MC/PC组，成纤维细胞亚型从17种扩展至19种；chord图与热图显示，高迁移体成纤维细胞（MigrasomeHigh-Fibro）与肿瘤相关巨噬细胞、血管内皮细胞通讯频繁，且PERIOSTIN、ncWNT、FGF等促转移通路显著激活；机制分析表明，MigrasomeHigh-Fibro是PERIOSTIN信号网络的核心枢纽，可激活PI3K/Akt通路，同时调控多个促转移通路；Sankey图揭示了成纤维细胞主导的信号网络层级结构。这些结果表明，TSPAN4⁺成纤维细胞通过丰富的细胞间通讯网络，尤其是激活多个促转移信号通路，成为胰腺癌TME中转移信号的关键传递者。

 

4、空间转录组与代谢通路分析

通过UMAP聚类将胰腺癌组织分为14个转录组学不同的细胞模块，空间定位显示各模块呈区域化分布；DotPlot显示，TSPAN4与ITGA5在聚类4、13、14中高共表达，检测频率超80%；热图显示，高迁移体富集模块中氧化磷酸化、脂质代谢等能量代谢通路显著激活；跨队列验证识别出13种保守细胞生态型，空间分布显示微环境niche特征保守，聚类13为主要迁移体信号枢纽，且存在谷氨酰胺分解与核苷酸合成相关代谢重编程。这些结果表明，TSPAN4⁺成纤维细胞通过空间特异性调控代谢通路，驱动胰腺癌TME的代谢重编程，为肿瘤细胞提供能量支持与营养分配，促进转移微环境形成。

 

5、空间发育轨迹与特征基因富集分析

对不同细胞聚类的发育轨迹分析显示，聚类5→0轨迹中30个共调控模块主要富集于ECM分解通路，与间质重塑、侵袭微环境形成及PD-L1介导的免疫逃逸相关，反调控模块则与MAPK增殖通路负相关；聚类5→1轨迹中，整合素信号体为主要共调控网络，反调控模块涉及内体运输与受体回收；聚类8→5轨迹中，干扰素响应凋亡调控因子同步激活，反调控模块抑制ECM支架形成与氧化应激缓冲；聚类6→10、7→10轨迹分别激活ECM蛋白水解、FAK信号及avb3整合素机械感知通路，同时抑制白细胞募集与抗原呈递。这些结果表明，TSPAN4⁺成纤维细胞通过调控ECM重塑、免疫抑制及增殖信号通路，在胰腺癌空间发育轨迹中主导转移微环境的动态组装。

 

6、TSPAN4⁺成纤维细胞的空间分布与免疫调控分析

空间定位显示，高迁移体成纤维细胞呈同心圆分布于肿瘤-基质交界区；调控网络分析表明，高迁移体成纤维细胞与细胞毒性免疫细胞呈负相关，且与T细胞、巨噬细胞的界面倾向评分高；定量分析显示，高迁移体成纤维细胞在肿瘤侵袭边缘（para-15mm）富集；区域特异性细胞互作分析显示，肿瘤实质区存在T细胞-上皮细胞通讯，juxta-5mm区低迁移体成纤维细胞-内皮细胞互作促进血管生成，para-15mm区高迁移体成纤维细胞诱导免疫沉默；多区域验证证实，高迁移体成纤维细胞通过STAT3依赖的检查点激活抑制免疫反应，且在不同区域通过IL-10/TGFb、MMP9/VEGF-A、L1CAM-整合素等通路调控免疫抑制与肿瘤增殖。这些结果表明，TSPAN4⁺成纤维细胞在胰腺癌不同空间区域通过差异化通路，协调免疫抑制微环境形成，为肿瘤转移创造免疫豁免区。

 

7、TSPAN4⁺成纤维细胞的细胞网络中心性分析

图论中心性分析显示，TSPAN4⁺成纤维细胞是细胞间通讯的核心枢纽；边界信号分析表明，其作为基质-免疫中介，与内皮细胞、上皮细胞选择性互作；热图显示，其与Th2型T细胞、浆细胞互作增强，可能通过IgE调控抗肿瘤免疫；网络拓扑图显示，TSPAN4⁺成纤维细胞形成“中心-辐射”连接框架，连接CD14⁺髓系祖细胞、M2型巨噬细胞与血管单元；空间共定位分析发现，TSPAN4⁺成纤维细胞与CX3CR1⁺单核细胞在肿瘤侵袭区共定位；拟时序分析显示，成纤维细胞从静息态（聚类1）向激活态（聚类4-5）分化，TSPAN4表达逐步上调，且与ECM重塑、SOX9介导的恶性重编程同步。这些结果表明，TSPAN4⁺成纤维细胞作为胰腺癌TME的网络核心，通过整合基质、免疫与血管信号，主导转移微环境的网络组装。

 

8、TSPAN4⁺成纤维细胞的配体-受体互作网络

空间共定位分析显示，TSPAN4⁺成纤维细胞与巨噬细胞、内皮细胞在胰腺癌TME中呈区域特异性共定位；配体-受体（LR）网络分析显示，COL1A2-ITGB1复合物为关键biomechanical信号单元，且富集于基质-血管交界区；定向通讯分析表明，TSPAN4⁺成纤维细胞通过CXCL12-CXCR4通路调控巨噬细胞，通过VEGFC-VEGFR3通路调控内皮细胞；网络架构分析显示，TSPAN4⁺成纤维细胞整合TGFb1-LTBP1（纤维化）与ANGPT2-TIE1（血管生成）信号；LR通路整合显示，其通过MMP2/MMP9调控巨噬细胞吞噬（CD47-SIRPa）与血管屏障（JAM3-ITGAV），同时通过IL10-IL10R（免疫抑制）与LOXL2-EGFR（基质浓缩）协调微环境。这些结果表明，TSPAN4⁺成纤维细胞通过多维度LR网络，协调纤维化、血管生成与免疫抑制，为胰腺癌转移构建功能性微环境。

 

9、TSPAN4⁺成纤维细胞与免疫治疗响应的关联

TIDE算法分析显示，TSPAN4⁺成纤维细胞丰度与免疫治疗疗效呈负相关；多维度协方差分析表明，TSPAN4⁺成纤维细胞与CD8⁺T细胞功能障碍显著相关（p=7.51×10⁻⁶），且明确其基质起源（p=1.96×10⁻³⁷）；相关性网络显示，TSPAN4与CD27、CTLA4、PDCD1等免疫逃逸分子呈正相关，且同时关联激活型（CD28）与抑制型（TIM3）免疫受体；调控网络显示，TSPAN4与基质调控因子（TYRBP9、TSPAN9）、间质适应性标志物（VIM、VASN）存在转录互作；免疫组分分析显示，TSPAN4⁺成纤维细胞与FOXP3⁺调节性T细胞、未成熟B细胞招募正相关，与抗原呈递细胞互作减少；转录协方差网络显示，其与蛋白稳态（UBTQ1）、间质转化（WTIP）通路相关，且与基因组不稳定性负相关。这些结果表明，TSPAN4⁺成纤维细胞通过塑造免疫抑制微环境，降低胰腺癌免疫治疗响应，是免疫治疗耐药的重要调控因素。

 

10、TSPAN4干扰对胰腺癌细胞增殖与迁移的影响

qPCR验证显示，siRNA干扰TSPAN4后，SW1990与PANC-1细胞中TSPAN4 mRNA显著下调；CCK-8实验显示，干扰TSPAN4后，两细胞系在24-96h内增殖活性显著降低；克隆形成实验显示，干扰组克隆形成能力几乎完全丧失；划痕实验显示，48h时干扰组细胞迁移能力显著下降，SW1990侵袭率降低82%，PANC-1降低63%。这些结果表明，TSPAN4对胰腺癌细胞的增殖、克隆形成及迁移能力至关重要，干扰其表达可显著抑制胰腺癌细胞的恶性表型。

 

11、TSPAN4干扰对胰腺癌细胞侵袭与凋亡的影响

Transwell侵袭实验显示，干扰TSPAN4后，SW1990细胞侵袭能力降低4.7倍，PANC-1降低3.9倍；流式细胞术显示，干扰组细胞凋亡率显著升高，SW1990从0.08%升至11.6%，PANC-1从2.09%升至12.87%。这些结果表明，TSPAN4不仅促进胰腺癌细胞侵袭，还可抑制其凋亡，干扰TSPAN4表达可同时削弱癌细胞侵袭能力并激活凋亡通路。

 

结论

本研究通过多组学分析与功能验证，明确TSPAN4⁺成纤维细胞是胰腺癌转移微环境组装的关键协调者：其通过迁移体驱动TME代谢重编程，为肿瘤细胞提供能量支持；通过丰富的细胞间通讯网络与基质-免疫互作，塑造免疫抑制微环境，促进ECM重塑与血管生成；同时，TSPAN4对胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭至关重要，且其高表达与胰腺癌免疫治疗耐药相关。研究不仅揭示了TSPAN4⁺成纤维细胞在胰腺癌转移中的核心作用，还为胰腺癌治疗提供了新的潜在靶点，为改善胰腺癌预后与免疫治疗疗效提供了理论依据。