这研究思路绝了！用UC/PEG对比+多组学分析，把马齿苋外泌体的修护底细扒得明明白白！

全球约5.37亿人受糖尿病困扰，预计2045年发病率将增长46%，其中20%-25%的患者会出现慢性难愈性伤口，大幅增加截肢风险。糖尿病伤口愈合延迟与炎症持续、细胞增殖受抑及氧化应激密切相关，而现有临床治疗手段功能单一，难以应对组织再生的复杂过程。

中药来源的外泌体样纳米囊泡（TCM-DENs）因生物相容性好、安全性高且可大规模生产，在慢性难愈性伤口治疗中展现出独特潜力，但目前针对中药不同状态和提取工艺的研究较少，限制了其临床转化。马齿苋作为药食同源植物，具有抗炎、抗氧化等多种生物活性，但其传统提取方法存在生物利用度低、靶向递送效率不足等问题，且尚未有关于马齿苋来源外泌体分离、表征及治疗糖尿病伤口潜力的系统研究。此外，TCM-DENs开发中，原料状态（新鲜与干燥）和提取技术（超速离心UC与聚乙二醇PEG沉淀）缺乏系统比较，也制约了其临床应用。

今天分享的是发表在【J Adv Res】（IF：13）上题为“Bioactivity and multi-omics profiling of purslane-derived nanovesicles with therapeutic implications in diabetic wounds”的研究。该研究以马齿苋为研究对象，系统比较不同状态（新鲜、干燥）和提取方法（UC、PEG沉淀）获得的马齿苋来源外泌体（Po-DENs）的特性与生物活性，通过多组学分析鉴定关键功能代谢物和蛋白质，并在体内外验证其治疗糖尿病伤口的潜力。

 

研究结果

1、马齿苋来源外泌体（Po-DENs）的纯化与表征

图1A：展示了Po-DENs的提取方法示意图，包括超速离心结合密度梯度离心法以及PEG沉淀法的流程。

图1B：呈现了蔗糖梯度超速离心后形成的条带，新鲜马齿苋（F-Po）在30%-45%和45%-60%蔗糖溶液界面出现两条带，干燥马齿苋（D-Po）在8%-30%、30%-45%和45%-60%蔗糖溶液界面出现三条带。

图1C：显示了通过UC-蔗糖密度梯度离心和PEG法分离的马齿苋外泌体不同组分的纯度，新鲜马齿苋外泌体在30%-45%蔗糖溶液界面纯度最高，干燥马齿苋外泌体在8%-30%和30%-45%蔗糖溶液界面纯度相近且高于45%-60%界面，同时8%PEG浓度下新鲜和干燥马齿苋外泌体纯度均最高。

图1D：为四种Po-DENs的透射电镜（TEM）图像，四种外泌体均呈现完整的双层膜结构和圆形外泌体状结构，粒径在100-200nm，符合典型的细胞外泌体特征。

图1E：通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定的四种外泌体粒径分布，超速离心法提取的外泌体粒径小于PEG沉淀法，F-Po-UC粒径约165nm，D-Po-UC约175nm，F-Po-PEG和D-Po-PEG约200nm，且四种外泌体粒径均呈单峰正态分布；同时还测定了四种外泌体的zeta电位，分别为-30.8mV、-37.9mV、-35.7mV和-30.7mV，表明提取的外泌体稳定性良好。

图1G：四种Po-DENs的SDS-PAGE分析结果，呈现了不同外泌体的蛋白质条带分布差异。

这些结果表明，不同提取方法和马齿苋原料状态会影响Po-DENs的纯度、粒径分布、形态及稳定性，其中新鲜马齿苋经超速离心（F-Po-UC）和8%PEG浓度提取的外泌体在纯度等方面表现较好，且所有外泌体均具备典型细胞外泌体特征和良好稳定性。

 

2、Po-DENs的蛋白质组学分析

图2A：展示了本研究中用于Po-DENs的代谢组学和蛋白质组学分析的示意图，包括对F-Po-UC、F-Po-PEG、D-Po-UC、D-Po-PEG四种外泌体的相关性分析、差异分析及通路分析等。

图2B：四种Po-DENs的蛋白质组学相关性分析结果，显示平行样本间结果一致性高、可重复性好，且不同外泌体组分间存在明显差异。

图2C：四种差异表达Po-DENs蛋白质重叠情况的韦恩图，F-Po-UC组鉴定出的蛋白质显著多于其他三组，其中F-Po-UC有407种特异性蛋白质。

图2D：四种Po-DENs中所有蛋白质的亚细胞定位情况，差异蛋白质主要来源于膜、叶绿体和大型胞质核糖体亚基。

图2E：F-Po-UC中独特蛋白质的基因本体（GO）分析结果，涉及ATP和GTP结合活性等功能。

图2F：F-Po-UC中独特蛋白质的京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析结果，参与代谢途径、氨基酸生物合成和次级代谢物生物合成等通路。

这些结果表明，新鲜与干燥马齿苋及不同提取方法对Po-DENs的蛋白质组成影响显著，F-Po-UC富含与细胞修复、能量转换及信号传导相关的独特蛋白质，且其蛋白质组成与功能通路更有利于发挥生物活性，而干燥过程可能导致部分功能蛋白质降解或表达下调。

 

3、Po-DENs的代谢组学分析

图3A：四种Po-DENs的主成分分析（PCA）结果，表明四种外泌体可有效分组，且从干燥马齿苋中提取的两种外泌体间差异较小。

图3B：四种Po-DENs成分组成的饼图，显示Po-DENs富含脂质、木质素、香豆素、有机酸、苯及其衍生物等，其中F-Po-UC中杂环化合物（7.3%）和甘油三酯化合物（5%）含量高于其他三组，且UC法提取的外泌体中苯及其衍生物含量低于PEG法。

图3C：F-Po-UC与F-Po-PEG、D-Po-UC与D-Po-PEG、F-Po-UC与D-Po-UC组外泌体间的差异代谢物数量，分别为159种、114种和204种。

图3D：四种外泌体中排名前5的代谢物，亚油酸（LinoleicAcid-d4）在四种外泌体中含量均最高，同时还包含Bergaptol等具有生物活性的代谢物。

这些结果表明，马齿苋原料状态和提取方法会导致Po-DENs的代谢物组成产生明显差异，F-Po-UC富含多种具有抗氧化、抗炎及促进组织修复功能的代谢物，如亚油酸、Bergaptol等，且其代谢物组成更有利于发挥糖尿病伤口治疗相关的生物活性。

 

4、Po-DENs治疗糖尿病伤口的分子机制

图4A：Po-DENs与糖尿病伤口潜在靶基因的交集情况，Po-DENs中的活性化合物关联483个预测基因靶点，其中366个基因与糖尿病伤口调控网络重叠。

图4B：Po-DENs与糖尿病伤口的潜在靶点基因网络示意图，展示了成分-靶点-疾病-通路间的关联。

图4C：分子与靶蛋白间的分子对接图，如亚油酸（Linoleic Acid）与TP53、STAT3的对接，Rhodojaponin III 9,11 -二乙酸酯与STAT3的对接，海藻糖（Trehalose）与AKT1、STAT3的对接，以及Cinegalline与AKT1、STAT3的对接，其中Rhodojaponin III 9,11-二乙酸酯与三个治疗靶点的结合能均小于-10kcal/mol，可良好嵌入靶点活性口袋，亲和力强。

这些结果表明，Po-DENs中的活性成分可通过作用于糖尿病伤口相关的多个靶基因，调控TNF、凋亡、化学致癌性-活性氧及糖尿病心肌病等关键通路，且部分活性成分与糖尿病伤口治疗关键靶点具有强结合亲和力，为其治疗糖尿病伤口的分子机制提供了依据。

 

5、Po-DENs的生物相容性与促迁移能力

图5A：研究Po-DENs的两种细胞（人角质形成细胞HaCaT和人皮肤成纤维细胞HSF）生物相容性示意图。

图5B：PKH26标记的Po-DENs与HSF共培养3小时的图像，在HSF细胞质（钙黄绿素AM染色，绿色）中可见红色荧光信号的Po-DENs，证实Po-DENs可被HSF内化。

图5C：HSF和HaCaT用PBS或Po-DENs处理不同时间后经Calcein AM/EthD-1染色的结果，绿色荧光表示活细胞，红色表示死细胞，四种外泌体均未引起明显细胞死亡，显示良好生物相容性。

图5D：不同浓度（0、5、10、20、40μg/mL）Po-DENs处理24、48、72小时后HSF的细胞活力，即使在20μg/mL高浓度下，Po-DENs也未降低细胞活力，且F-Po-UC促细胞活性显著。

图5E：F-Po-UC处理的HSF和HaCaT通过划痕实验测定的迁移能力，20μg/mLF-Po-UC处理HSF24小时后伤口愈合率达40.46%，是对照组的3倍，HaCaT实验结果类似，F-Po-UC促迁移效果显著。

这些结果表明，Po-DENs具有优异的生物相容性，不会对HaCaT和HSF造成细胞毒性，且F-Po-UC在促进皮肤细胞（HaCaT和HSF）增殖和迁移方面表现突出，其效果与Annexin家族蛋白、延伸因子1-α（EF1α）等活性蛋白成分相关，为皮肤修复应用提供了基础。

 

6、Po-DENs的体外抗氧化与抗炎实验

图6A：Po-DENs的ROS清除、抗凋亡及抗炎实验示意图。

图6B：HSF/HaCaT经H₂O₂和四种Po-DENs处理后的ROS水平流式细胞术分析结果，与H₂O₂处理的阳性对照组相比，Po-DENs处理后两种细胞ROS水平均降低，新鲜马齿苋来源外泌体（F-Po-UC/PEG）荧光强度下降更显著，ROS清除能力更强。

图6C：HSF/HaCaT经H₂O₂和四种Po-DENs处理后的细胞内ROS水平荧光图，显示Po-DENs处理后ROS过量细胞比例下降。

图6D：HSF/HaCaT经H₂O₂和四种Po-DENs处理后的凋亡流式细胞术数据，新鲜马齿苋来源外泌体（F-Po-UC/PEG）比干燥马齿苋来源外泌体（D-Po-UC/PEG）更能显著降低两种细胞的凋亡水平。

图6E：Po-DENs处理后抗炎基因表达情况，与PBS处理的对照组相比，Po-DENs处理组促炎细胞因子IL-6、IL-1β表达显著降低，抗炎细胞因子IL-10显著上调。

图6F：Po-DENs处理后抗炎蛋白表达情况，与对照组相比，Po-DENs处理组相关抗炎蛋白表达发生相应变化。

这些结果表明，Po-DENs具有良好的体外抗氧化和抗炎能力，能有效清除细胞内ROS、抑制细胞凋亡，且新鲜马齿苋来源外泌体效果更优，其机制与F-Po-UC中富集的调节NFκB、PPARγ等炎症相关信号通路的代谢物有关，为治疗糖尿病慢性伤口提供了实验支持。

 

7、Po-DENs促进伤口愈合的蛋白质组学分析

图7A：HaCaT细胞经H₂O₂造模和Po-DENs处理后的蛋白质组学分析示意图。

图7B：对照组、H₂O₂处理组和Po-DENs处理组蛋白质含量的韦恩图，共鉴定出4293种蛋白质。

图7C：抗氧化相关蛋白质重叠情况的韦恩图，展示了H₂O₂处理后上调但经Po-DENs处理后下调，以及H₂O₂处理后下调但经Po-DENs处理后恢复的蛋白质。

图7D：差异表达蛋白质（DEPs）的热图，呈现了不同处理组间蛋白质表达差异。

图7E：DEPs的火山图，显示了蛋白质表达的显著差异情况。

图7F：DEPs的代表性GO分析，涉及与伤口愈合相关的功能。

图7G：DEPs的KEGG聚类分析，富集了黏着斑、ECM-受体相互作用和MAPK信号通路等与糖尿病伤口愈合相关的经典通路。

图7H：Po-DENs处理后（Po-DENs组/H₂O₂组）发生显著变化（FC>2）的代表性DEPs，包括角蛋白（KRT3、KRT5等）。

图7I：Po-DENs介导H₂O₂损伤修复作用的示意图，展示了其通过抗凋亡、组织再生和抗炎机制促进修复的过程。

图7J：p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR及相关通路蛋白质的western blot结果，Po-DENs处理后p-AKT和p-mTOR表达上调，整合素ITGB4和ITGA6表达增加。

图7K：western blot结果中p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR及相关通路蛋白质的定量分析。

图7L：ITGA6、ITGB4、CDK6、PGK1表达的qRT-PCR检测结果。

这些结果表明，Po-DENs可通过调控HaCaT细胞中多种蛋白质的表达，激活抗凋亡、组织再生和抗炎机制，如激活AKT/mTOR信号通路、上调角蛋白等伤口愈合相关蛋白，增强细胞黏附、增殖和迁移能力，同时调节炎症反应，构建“促增殖-抗凋亡-抗炎”的修复网络，有效促进H₂O₂诱导的细胞损伤修复。

 

8、Po-DENs促进糖尿病伤口愈合的体内实验

图8A：C57BL/6小鼠实验方案示意图，展示了从STZ注射建立糖尿病模型到伤口创建、干预及组织取样的时间线。

图8B：正常组、对照组、GM组和Po-GM组小鼠伤口愈合和皮肤再生的代表性图像，记录了第0、3、7、10、14天的伤口情况。

图8C：不同时间点相对伤口愈合率的定量数据，与正常组相比，对照组伤口愈合显著受抑；第3天起GM组和Po-GM组均加速伤口愈合，且Po-GM组效果更优。

图8D：第14天再生组织的HE和Masson染色结果，正常组皮肤结构较完整，角质层薄，炎性细胞浸润少；对照组角质层增厚，伤口宽；GM组和Po-GM组伤口宽度减小，Po-GM组伤口进一步收缩，皮肤附属器增多，组织形态更接近正常组。

图8E：相应计算的伤口边缘长度，Po-GM组伤口边缘收缩更明显。

图8F：胶原沉积定量分析，Po-GM组处理的伤口新组织中胶原沉积更多，增加了37%。

图8G：再生区域的免疫荧光（CD31和IL-6）染色结果，Po-GM组血管生成相关标志物CD31含量增加，炎性细胞因子IL-6含量降低。

图8H：不同浓度Po-DENs对红细胞溶血作用的影响，所有浓度下Po-GM诱导的溶血率均低于5%。

图8I：不同组小鼠心、肝、脾、肺、肾的HE染色结果，各组间无明显炎症或不良反应，组织形态无显著差异。

这些结果表明，Po-DENs（F-Po-UC）与GelMA结合形成的Po-GM水凝胶敷料在糖尿病小鼠模型中能显著加速伤口愈合，促进胶原沉积和血管生成，减轻炎症反应，且具有良好的生物安全性，对主要器官无不良影响，为糖尿病伤口治疗提供了有效的天然治疗策略。

 

结论

本研究通过对新鲜和干燥马齿苋采用超速离心（UC）与聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的四种纳米外泌体（Po-DENs）进行系统研究，发现新鲜马齿苋经超速离心提取的外泌体（F-Po-UC）在体外具有更优的抗氧化、抗炎、促细胞增殖和迁移能力，通过多组学分析鉴定出其富含与组织再生相关的生物活性成分，且在体内实验中，F-Po-UC与GelMA结合形成的敷料能显著加速糖尿病小鼠伤口愈合，同时具备良好生物安全性；综上，新鲜马齿苋来源的F-Po-UC外泌体具有优异的糖尿病伤口治疗潜力，为植物来源外泌体的临床应用提供了科学依据，也为再生医学中天然药物研究开辟了新方向。