外泌体的“超能力”：机械拉伸改造后，脂肪源性干细胞外泌体加速糖尿病骨折骨再生！

糖尿病患者骨折后出现骨不连或延迟愈合是一种严重的并发症，迫切需要新的治疗策略，而来自基质细胞的外泌体是天然存在的纳米颗粒，携带生物活性分子，介导细胞间通讯，在糖尿病骨折修复中发挥着关键作用。重要的是，机械刺激可以调节外泌体的货物组成，从而影响骨愈合结果。基于此，以下文章首次研究机械拉伸的脂肪源性基质细胞（MS-ADSC-Exos）衍生的外泌体是否能促进2型糖尿病（T2DM）骨不连模型中的骨折愈合，并阐明其潜在机制。

今天分享的是一篇发表在【Stem Cell Res Ther】（IF：7.3）上题为“MiR-877, an exosomal miRNA from mechanical stretch induced adipose derived stromal cells, enhances fracture healing in nonunion rats with type 2 diabetes mellitus”的研究，该研究将不同机械拉伸幅度的脂肪源性干细胞（ADSCs）分泌的外泌体应用于体外培养的大鼠骨髓间充质基质细胞（BMSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。通过茜素红S和碱性磷酸酶（ALP）染色、管形成、划痕和迁移实验分别评估成骨分化、增殖、迁移和血管生成情况；通过蛋白质印迹法和免疫荧光法评估成骨标志物的表达。在体内实验中，术后连续3天将MS-ADSC-Exos或磷酸盐缓冲液（PBS）局部注射到糖尿病大鼠股骨骨不连模型的骨折部位；在术后4周通过微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学分析评估骨再生情况，通过RNA测序、生物信息学和实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）表征MS-ADSC-Exos的miRNA图谱，模拟物和抑制剂转染实验进一步验证miR-877的功能作用。结果表明，miR-877在LMS-ADSC-Exos中显著上调，并可转移到BMSCs和HUVECs中，从而促进糖尿病患者的成骨和血管生成。

 

研究成果

1. ADSC-exos的表征和鉴定

图1A：ADSCs的形态观察。结果显示，从大鼠腹股沟皮下脂肪分离培养的ADSCs在体外呈贴壁生长，形态为典型的梭形。

图1B：ADSCs表面标志物的流式细胞术鉴定。结果显示，ADSCs高表达间充质干细胞阳性标志物CD44和CD90，低表达或不表达造血干细胞阴性标志物CD34和CD45。

图1C：ADSC-Exos的形态与粒径分析。结果显示，透射电镜（TEM）下ADSC-Exos呈典型的“杯状”结构；纳米颗粒追踪分析（NTA）显示其粒径分布在30-200nm之间，平均直径约120nm。

图1D：ADSC-Exos特异性标志物的Western blot检测。结果显示，ADSC-Exos表达外泌体核心标志物CD9（23kDa）、CD63（35kDa）及TSG101（44kDa）。

图1E：BMSCs对ADSC-Exos的摄取实验。结果显示，用红色荧光染料PKH26标记的ADSC-Exos与BMSCs共培养12h后，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下可见红色荧光（外泌体）与BMSCs的细胞骨架（鬼笔环肽染色）、细胞核（DAPI染色，蓝色）共定位。

这些结果表明实验成功从大鼠皮下脂肪分离并鉴定了ADSCs，且从ADSCs中提取的外泌体符合典型特征，可被骨愈合关键细胞BMSCs有效摄取。

 

2.循环机械拉伸诱导的ADSCs-外泌体在体外促进BMSCs的成骨分化

图2A：BMSCs成骨分化的茜素红染色（ARS）结果。结果显示，成骨诱导14天后，LMS-Exos组的红色矿化结节数量显著多于PBS组、NMS-Exos组，而HMS-Exos组矿化结节数量显著少于其他三组。

图2B：BMSCs成骨分化的碱性磷酸酶（ALP）染色结果。结果显示，LMS-Exos组的ALP阳性染色（深色区域）强度显著高于其他三组，HMS-Exos组染色强度最弱。

图2C-D：ARS和ALP染色的半定量分析。结果显示，LMS-Exos组的矿化程度（ARS定量）和ALP活性（ALP定量）显著高于PBS组、NMS-Exos组，HMS-Exos组显著低于其他三组。

图2E-F：BMSCs中成骨标志物RUNX2、OCN的Western blot检测。结果显示，LMS-Exos上调成骨标志物蛋白表达。

图2G-H：Western blot结果的定量分析。结果显示，LMS-Exos组RUNX2、OCN的蛋白相对表达量显著高于PBS组、NMS-Exos组，HMS-Exos组显著低于其他三组。

图2I：BMSCs中RUNX2、OCN的免疫荧光染色。结果显示，细胞核经DAPI染色（蓝色），RUNX2、OCN为特异性荧光（绿色）；LMS-Exos组的绿色荧光强度显著强于其他三组，HMS-Exos组荧光最弱。

这些结果表明低机械拉伸诱导的ADSC-Exos（LMS-Exos）在体外可显著促进BMSCs的成骨分化（表现为矿化增强、ALP活性升高、成骨标志物RUNX2/OCN表达上调），而高机械拉伸的ADSC-Exos（HMS-Exos）则抑制BMSCs成骨分化，且该效应具有“机械拉伸强度依赖性”。

 

3.循环机械拉伸诱导的ADSCs-外泌体在体外促进血管生成

图3A、D：HUVECs迁移能力的划痕愈合实验及定量。结果表明LMS-Exos促进HUVECs迁移，HMS-Exos抑制迁移。

图3B、E：HUVECs迁移能力的Transwell实验及定量。结果显示，结晶紫染色后，LMS-Exos组穿过Transwell小室的HUVECs数量显著多于其他三组，HMS-Exos组迁移细胞数最少；定量分析证实LMS-Exos组迁移细胞数显著高于PBS组、NMS-Exos组，HMS-Exos组显著降低。

图3C、F：HUVECs血管生成能力的管形成实验及定量。结果显示，荧光显微镜下，LMS-Exos组HUVECs形成的“管结构”（长度、分支数）显著多于其他三组，HMS-Exos组管结构最少；定量分析显示LMS-Exos组平均管长度显著高于其他三组，HMS-Exos组显著降低。

图3G、H：HUVECs中血管生成标志物VEGF、CD31的Western blot检测及定量。结果显示，以GAPDH为内参，LMS-Exos组VEGF、CD31的蛋白表达量显著高于PBS组、NMS-Exos组，HMS-Exos组显著低于其他三组。

这些结果表明低机械拉伸诱导的ADSC-Exos（LMS-Exos）在体外可显著促进HUVECs的血管生成相关功能（迁移能力增强、管结构形成增多、血管标志物VEGF/CD31表达上调），而高机械拉伸的HMS-Exos则抑制血管生成，与成骨分化的“强度依赖性”规律一致。

 

4.循环机械拉伸诱导的ADSCs- Exos促进非愈合大鼠骨折模型中BMSCs的成骨分化和骨愈合

图4A：实验设计示意图。

图4B：大鼠股骨的Micro-CT扫描结果。结果显示，3D重建、矢状面及横断面图像中，LMS-Exos组骨折间隙显著缩小，骨痂体积显著大于PBS组、NMS-Exos组；HMS-Exos组骨折间隙最大，骨痂量最少。

图4C：骨体积/总体积（BV/TV）的定量分析。结果显示，LMS-Exos组的BV/TV（骨再生关键指标）显著高于PBS组、NMS-Exos组。

图4D：骨折区域成骨标志物的免疫组化染色。结果显示，RUNX2、OCN的阳性染色细胞数（棕色）在LMS-Exos组显著多于其他三组。

图4E：骨折区域血管标志物的免疫荧光染色。结果显示，α-SMA（血管平滑肌标志物）、CD31（血管内皮标志物）的荧光强度在LMS-Exos组显著强于其他三组。

这些结果表明，在T2DM骨不连大鼠体内，局部注射低机械拉伸诱导的ADSC-Exos（LMS-Exos）可显著促进骨折部位的骨再生（BV/TV升高、骨痂增多、成骨标志物上调）及血管生成（血管标志物上调），从而加速骨折愈合；而HMS-Exos则抑制骨愈合，验证了LMS-Exos的体内治疗效果。

 

5. MiR-877在循环机械拉伸诱导的ADSCs- Exos中表达上调

图5A：差异miRNA的热图分析。结果显示，与NMS-Exos相比，LMS-Exos中存在多个显著差异表达的miRNA，其中miR-877的上调幅度最为明显。

图5B：差异miRNA的火山图分析。结果进一步证实LMS-Exos中miR-877表达显著升高。

图5C：差异miRNA的KEGG通路分析。结果显示，差异miRNA富集于与“骨再生”“血管生成”相关的信号通路（如PI3K-Akt通路）。

图5D：6个上调miRNA的qRT-PCR验证。结果显示，与NMS-Exos相比，LMS-Exos中miR-145-3p、miR-30c-1-3p、miR-877等6个miRNA均上调，其中miR-877的上调幅度显著高于其他5个miRNA，为核心差异miRNA。

图5E-F：BMSCs中miR-877的表达检测。结果显示，与PBS组、NMS-Exos组相比，LMS-Exos处理的BMSCs中miR-877表达量显著升高。

图5G-H：HUVECs中miR-877的表达检测。结果显示，与PBS组、NMS-Exos组相比，LMS-Exos处理的HUVECs中miR-877表达量显著升高。

这些结果表明低机械拉伸诱导的ADSC-Exos（LMS-Exos）中miR-877表达显著上调，且LMS-Exos可作为“载体”将miR-877转移至骨愈合关键受体细胞（BMSCs、HUVECs），使受体细胞内miR-877水平升高。

 

6.循环机械拉伸诱导的ADSCs- Exos通过体外上调miR-877表达促进成骨分化和血管生成，从而增强骨愈合

图6A：转染后BMSCs的成骨分化检测（ARS、ALP染色）。结果显示，与模拟物阴性对照（mimic-NC）相比，转染miR-877模拟物（miR-877 mimic）的BMSCs矿化结节（ARS）和ALP阳性染色显著增多；与抑制剂阴性对照（inhibitor-NC）相比，转染miR-877抑制剂（miR-877 inhibitor）的BMSCs染色显著减少。

图6B：转染后HUVECs的血管生成检测（管形成实验）。结果显示，miR-877 mimic组HUVECs形成的管结构显著多于mimic-NC组，miR-877 inhibitor组管结构显著少于inhibitor-NC组。

图6C-D：转染后细胞中miR-877的qRT-PCR验证。结果显示，miR-877 mimic组BMSCs、HUVECs中miR-877表达量显著高于对应阴性对照，miR-877 inhibitor组显著低于对应阴性对照。

图6E-F：成骨与血管生成的定量分析。结果显示，miR-877 mimic组BMSCs的矿化程度、ALP活性及HUVECs的管长度显著高于阴性对照，miR-877 inhibitor组显著降低。

图6G-J：转染后BMSCs中成骨标志物的Western blot检测及定量。结果显示，miR-877 mimic组RUNX2、OCN蛋白表达显著高于mimic-NC组，miR-877inhibitor组显著低于inhibitor-NC组。

图6K-N：转染后HUVECs中血管标志物的Western blot检测及定量。结果显示，miR-877 mimic组VEGF、CD31蛋白表达显著高于mimic-NC组，miR-877 inhibitor组显著低于inhibitor-NC组。

这些结果表明miR-877是LMS-Exos促进成骨分化和血管生成的“关键效应分子”——外源性过表达miR-877可模拟LMS-Exos的功能（促进BMSCs成骨、HUVECs血管生成），而抑制miR-877则会阻断该功能，明确了LMS-Exos→miR-877→成骨/血管生成的调控轴。

 

结论

本研究揭示了一种新型“机械生物学机制”——机械刺激可通过调节ADSCs外泌体的miRNA负载物（如上调miR-877），进而调控骨愈合关键细胞的功能，为“机械信号→细胞应答→骨再生”的调控网络提供了新视角。