实验闭环咋搭不迷茫？细胞→体内模型→类器官，这篇外泌体研究证据链超扎实！IF:9+发文逻辑轻松学

肺癌是全球范围内极具危害性的恶性肿瘤，其中肺腺癌（LUAD）作为非小细胞肺癌（NSCLC）的主要亚型，约占肺癌病例的40%，晚期患者预后极差，5年总生存率不足20%。自2002年发现驱动癌基因以来，靶向治疗成为晚期LUAD治疗的重要方向，但耐药问题常导致治疗效果受限。表皮生长因子受体（EGFR）突变在LUAD中较为常见，奥希替尼作为第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI），虽能有效靶向敏感EGFR突变及耐药T790M突变，却仍无法避免耐药现象的发生。研究表明，c-MET扩增是奥希替尼一线和二线治疗中常见的耐药机制之一，然而其具体作用机制尚不明确，且缺乏有效延长耐药患者生存期的治疗策略。

外泌体作为细胞间通讯的关键介质，可通过传递信号分子影响受体细胞行为，在肿瘤进展、免疫抑制及放化疗耐药中发挥重要作用。长链非编码RNA（lncRNA）LUCAT1已被证实与多种癌症的化疗耐药相关，但外泌体LUCAT1在肿瘤靶向药物耐药中的作用尚未明确。

今天分享的是发表在【Cell Death Dis】（IF：9.6）上题为“Hypoxia-induced exosomal LUCAT1 promotes osimertinib resistance in lung adenocarcinoma by stabilizing c-MET”的研究，该研究旨在阐明缺氧诱导外泌体（HExo）在促进LUAD对奥希替尼耐药中的功能与机制，明确外泌体LUCAT1的作用，为寻找诊断生物标志物和治疗靶点提供依据。

 

研究结果

1、缺氧来源外泌体在体内外诱导EGFR突变型LUAD对奥希替尼耐药

图1A：通过Western blot检测H1975和HCC827细胞在缺氧与常氧条件下缺氧标志物HIF-1α、PDK1、GLUT1及内参GAPDH的蛋白表达，结果显示缺氧条件下HIF-1α、PDK1、GLUT1表达显著升高，成功构建缺氧细胞模型。

图1B：绘制缺氧和常氧条件下H1975、HCC827细胞经不同浓度奥希替尼处理48小时的剂量反应曲线，缺氧组细胞对奥希替尼的半数抑制浓度显著高于常氧组，表明缺氧降低细胞对奥希替尼的敏感性。

图1C：Western blot检测H1975和HCC827细胞来源外泌体中特异性蛋白CD63、CD81、TSG101的表达，证实成功分离出外泌体。

图1D：奥希替尼耐药细胞与亲本H1975、HCC827细胞来源外泌体的透射电镜（TEM）图像，外泌体呈典型囊泡状结构。

图1E：H1975和HCC827细胞与PKH67标记（绿色）的HExo共培养后的免疫荧光图像，在细胞内观察到绿色荧光，证实HExo可被LUAD细胞内化。

图1F：H1975和HCC827细胞经HExo（或PBS对照）预处理24小时后，再用不同浓度奥希替尼处理48小时的细胞活力检测结果，HExo组细胞活力显著高于对照组，表明HExo降低细胞对奥希替尼的敏感性。

图1G-H：H1975（上图）和HCC827（下图）细胞与HExo共培养并经不同浓度奥希替尼处理2周的集落形成实验结果，包括代表性图像和集落平均数量统计，HExo组集落数量显著多于对照组，进一步证实HExo促进细胞对奥希替尼耐药。

图1I-J：H1975细胞（3×10⁶个）在NCG小鼠皮下移植，经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植实验结果，包括肿瘤体积和重量统计，HExo处理组在奥希替尼治疗下肿瘤体积和重量显著大于对照组，且无奥希替尼处理时HExo对肿瘤大小无显著影响。

图1K-L：经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植肿瘤组织的HE染色和Ki67免疫组化（IHC）染色结果及Ki67阳性率定量分析，HExo处理组Ki67阳性率显著高于对照组，表明HExo促进肿瘤细胞增殖。

图1M-N：经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植肿瘤组织中凋亡细胞比例的TUNEL染色分析结果及TUNEL阳性细胞定量，HExo处理组TUNEL阳性细胞比例显著低于对照组，表明HExo抑制奥希替尼诱导的细胞凋亡。

这些结果表明，缺氧来源的外泌体（HExo）可在体内外显著降低EGFR突变型LUAD细胞对奥希替尼的敏感性，通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡来诱导耐药。

 

2、外泌体中LUCAT1的鉴定

图2A-B：H1975细胞来源HExo和常氧诱导外泌体（NExo）的lncRNA测序数据，分别以火山图和热图呈现，筛选出13个差异表达lncRNA，其中9个在HExo中高表达。

图2C：TCGA队列中LUCAT1在癌旁组织和肿瘤组织中的相对表达水平，肿瘤组织中LUCAT1表达显著高于癌旁组织。

图2D-E：根据TCGA队列中NSCLC患者LUCAT1表达中位数分组，绘制高、低LUCAT1表达组的总生存期（OS，D）和疾病特异性生存期（DSS，E）Kaplan-Meier曲线，高LUCAT1表达组患者OS和DSS显著缩短（D中P=0.037）。

图2F：qRT-PCR检测H1975和HCC827细胞来源HExo和NExo中LUCAT1的表达，HExo中LUCAT1表达显著高于NExo。

图2G：H1975和HCC827细胞与HExo（或PBS对照）共培养48小时后，qRT-PCR检测LUCAT1的表达，共培养组LUCAT1表达显著高于对照组。

图2H：H1975和HCC827细胞条件培养基经RNaseA（2mg/ml）单独处理或联合Triton X-100（0.1%）处理后，qRT-PCR检测LUCAT1表达，单独RNaseA处理对LUCAT1表达无显著影响，联合处理则显著降低其表达。

图2I：qRT-PCR检测NExo、HExo及HExo+GW4869（外泌体合成释放抑制剂）组中LUCAT1的表达，HExo+GW4869组LUCAT1表达显著低于HExo组。

这些结果表明，LUCAT1可被缺氧诱导的外泌体包裹并传递至受体细胞，且外泌体的脂质双分子层能保护LUCAT1免受降解，同时LUCAT1高表达与NSCLC患者不良预后相关。

 

3、LUCAT1上调促进LUAD在体内外对奥希替尼耐药

图3A：qRT-PCR检测奥希替尼耐药H1975/OR、HCC827/OR细胞与亲本细胞中LUCAT1的表达，耐药细胞中LUCAT1表达显著高于亲本细胞。

图3B：qRT-PCR检测LUCAT1过表达（OE-LUCAT1）和对照（OE-ctrl）LUAD细胞中LUCAT1的表达，过表达组LUCAT1表达显著升高。

图3C：OE-LUCAT1和对照LUAD细胞经不同浓度奥希替尼处理48小时的细胞活力检测，过表达组细胞活力显著高于对照组。

图3D-E：OE-LUCAT1和对照LUAD细胞经不同浓度奥希替尼处理2周的集落形成实验，包括代表性图像和集落平均数量统计，过表达组集落数量显著多于对照组。

图3F-G：OE-LUCAT1和对照H1975细胞（3×10⁶个）在NCG小鼠皮下移植，经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植实验，包括肿瘤体积和重量统计，过表达组在奥希替尼治疗下肿瘤体积和重量显著大于对照组，且无奥希替尼时两组无显著差异。

图3H-I：经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植肿瘤组织的HE染色和Ki67 IHC染色及Ki67阳性率定量，过表达组Ki67阳性率显著高于对照组。

图3J-K：经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植肿瘤组织中凋亡细胞比例的TUNEL染色及TUNEL阳性细胞定量，过表达组TUNEL阳性细胞比例显著低于对照组。

这些结果表明，LUCAT1上调可在体内外显著降低EGFR突变型LUAD细胞对奥希替尼的敏感性，通过促进细胞增殖、抑制凋亡诱导耐药。

 

4、LUCAT1敲低恢复LUAD在体内外对奥希替尼的敏感性

图4A：qRT-PCR检测H1975/OR和HCC827/OR细胞转染LUCAT1 shRNA 72小时后LUCAT1的表达，敲低组LUCAT1表达显著低于对照（sh-ctrl）组。

图4B：LUCAT1敲低和对照H1975/OR（左）、HCC827/OR（右）细胞经不同浓度奥希替尼处理48小时的细胞活力检测，敲低组细胞活力显著低于对照组。

图4C-D：LUCAT1敲低和对照H1975/OR（上）、HCC827/OR（下）细胞经不同浓度奥希替尼处理2周的集落形成实验，包括代表性图像和集落平均数量统计，敲低组集落数量显著少于对照组。

图4E-F：LUCAT1敲低和对照H1975/OR细胞（3×10⁶个）在NCG小鼠皮下移植，经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植实验，包括肿瘤体积和重量统计，敲低组在奥希替尼治疗下肿瘤体积和重量显著小于对照组。

图4G：经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植肿瘤组织的HE染色和Ki67 IHC染色，敲低组Ki67阳性细胞比例低于对照组。

图4H：经溶剂或奥希替尼（5mg/kg）处理的异种移植肿瘤组织中凋亡细胞比例的TUNEL染色，敲低组TUNEL阳性细胞比例高于对照组。

这些结果表明，LUCAT1敲低可在体内外恢复EGFR突变型LUAD耐药细胞对奥希替尼的敏感性，通过抑制细胞增殖、促进凋亡逆转耐药。

 

5、耐药细胞来源外泌体通过细胞间传递LUCAT1扩散奥希替尼耐药性

图5A：H1975和HCC827细胞与LUCAT1过表达（OE）LUAD细胞来源外泌体共培养48小时后，qRT-PCR检测LUCAT1的表达，共培养组LUCAT1表达显著升高。

图5B：H1975和HCC827细胞与奥希替尼耐药（OR）LUAD细胞来源外泌体共培养48小时后，qRT-PCR检测LUCAT1的表达，共培养组LUCAT1表达显著升高。

图5C-D：H1975和HCC827细胞与指定外泌体共培养后，经不同浓度奥希替尼处理48小时的细胞活力检测，与OE-LUCAT1或OR细胞来源外泌体共培养的细胞活力显著高于对照。

图5E-F：H1975和HCC827细胞与指定外泌体共培养后，经不同浓度奥希替尼处理3周的集落形成实验，与OE-LUCAT1或OR细胞来源外泌体共培养的细胞集落数量显著多于对照。

图5G：8例EGFR突变型LUAD患者来源肿瘤类器官的代表性明场图像、HE染色及Ki67、NapsinA、TTF-1的IHC染色结果。

图5H：EGFR突变型LUAD类器官经不同浓度奥希替尼处理3天的ATP活力检测，4个类器官（136#、19#、124#、120#）对奥希替尼耐药，4个（61#、30#、43#、306#）敏感。

图5I：qRT-PCR检测EGFR突变型LUAD类器官中LUCAT1的表达，耐药类器官中LUCAT1表达显著高于敏感类器官。

图5J：306#类器官与指定外泌体（40μg/ml）共培养后，经不同浓度奥希替尼处理3天的ATP活力检测，与OR细胞来源外泌体共培养的类器官活力显著高于对照。

这些结果表明，耐药细胞来源的外泌体可通过细胞间传递LUCAT1，将奥希替尼耐药性扩散至敏感的EGFR突变型LUAD细胞及类器官。

 

6、LUCAT1通过阻止c-MET降解上调其蛋白表达

图6A：Western blot检测OE-LUCAT1和对照H1975、HCC827细胞中10种受体酪氨酸激酶（RTKs）的表达，仅c-MET蛋白水平在过表达组显著上调，其他RTKs无显著变化。

图6B：TCGA队列中NSCLC组织LUCAT1与c-MET表达的Pearson相关性分析，二者呈显著正相关。

图6C-D：RIP实验检测H1975和HCC827细胞中c-MET与LUCAT1的相互作用，c-MET抗体组富集的LUCAT1显著多于IgG对照组。

图6E：Western blot检测LUCAT1敲低和对照H1975/OR、HCC827/OR细胞中c-MET的表达，敲低组c-MET蛋白水平显著降低。

图6F-G：qRT-PCR检测OE-LUCAT1和对照H1975、HCC827细胞及LUCAT1敲低和对照H1975/OR、HCC827/OR细胞中c-MET的mRNA表达，各组间无显著差异。

图6H：H1975和HCC827细胞中LUCAT1的荧光原位杂交（FISH）分析，LUCAT1主要定位于细胞质。

图6I-J：OE-LUCAT1和对照H1975、HCC827细胞经50μg/ml CHX处理不同时间后，Western blot检测c-MET蛋白稳定性，过表达组c-MET降解速率显著慢于对照组。

图6K-L：OE-LUCAT1和对照H1975、HCC827细胞（上）及LUCAT1敲低和对照H1975/OR、HCC827/OR细胞（下）经MG132（30μM，3小时）处理后，Western blot检测c-MET蛋白表达，MG132处理减弱了LUCAT1对c-MET蛋白水平的调控作用。

图6M：OE-LUCAT1和对照H1975、HCC827细胞经不同浓度奥希替尼处理24小时后，Western blot检测相关蛋白表达，过表达组AKT、mTOR、ERK磷酸化水平显著高于对照组，cleaved-PARP表达显著低于对照组。

图6N：OE-LUCAT1和对照H1975、HCC827细胞经100nM奥希替尼处理不同时间后，Western blot检测相关蛋白表达，过表达组AKT、mTOR、ERK磷酸化水平显著高于对照组。

这些结果表明，LUCAT1通过在转录后水平与c-MET相互作用，阻止其蛋白酶体依赖性降解，上调c-MET蛋白水平，并激活下游AKT/mTOR和ERK信号通路，进而诱导LUAD对奥希替尼耐药。

 

7、c-MET介导LUCAT1诱导的LUAD对奥希替尼耐药

图7A：转染指定载体的H1975和HCC827细胞经不同浓度奥希替尼处理48小时的剂量反应曲线，OE-LUCAT1+si-c-MET组细胞对奥希替尼的敏感性显著高于OE-LUCAT1+si-ctrl组。

图7B：OE-LUCAT1的H1975和HCC827细胞经奥希替尼和谷美替尼（c-MET特异性抑制剂）单独或联合处理48小时的剂量反应曲线，联合处理组细胞活力显著低于单独处理组。

图7C-D：OE-LUCAT1和对照H1975细胞（3×10⁶个）在NCG小鼠皮下移植，经溶剂、奥希替尼（5mg/kg）或联合谷美替尼（5mg/kg）处理的异种移植实验，包括肿瘤体积和重量统计，联合处理组肿瘤体积和重量显著小于其他组。

图7E：OE-LUCAT1和对照H1975细胞经溶剂、奥希替尼或联合谷美替尼处理24小时后，Western blot检测相关蛋白表达及定量分析，联合处理组AKT、mTOR、ERK磷酸化水平显著降低，cleaved-PARP表达显著升高。

这些结果表明，c-MET是LUCAT1介导LUAD对奥希替尼耐药的关键介质，靶向c-MET（如使用谷美替尼）可有效恢复耐药细胞对奥希替尼的敏感性。

 

8、外泌体LUCAT1作为EGFR突变型LUAD对奥希替尼耐药的诊断生物标志物

图8A：LUAD患者血浆来源外泌体的代表性TEM图像。

图8B：qRT-PCR检测LUAD患者和健康供体血浆来源外泌体中LUCAT1的表达，患者组LUCAT1表达显著高于健康组。

图8C：Western blot检测LUAD组织中c-MET和GAPDH的表达，LUCAT1高表达患者组织中c-MET蛋白水平显著高于低表达患者。

图8D：LUAD患者血浆来源外泌体中LUCAT1水平与组织中c-MET水平的Spearman相关性分析，二者呈显著正相关。

图8E：qRT-PCR检测对奥希替尼治疗有反应或无反应的EGFR突变型LUAD患者治疗前血浆来源外泌体中LUCAT1的表达，无反应组LUCAT1表达显著高于有反应组。

图8F：外泌体LUCAT1在LUAD对奥希替尼耐药中作用的示意图，缺氧细胞或耐药细胞分泌的外泌体携带LUCAT1传递至敏感细胞，通过稳定c-MET激活AKT/mTOR和ERK通路，诱导耐药。

这些结果表明，血浆外泌体LUCAT1水平与EGFR突变型LUAD患者对奥希替尼的耐药性密切相关，可作为评估奥希替尼治疗反应的潜在液体活检生物标志物。

 

结论

本研究发现，缺氧诱导的外泌体（HExo）可通过传递LUCAT1降低EGFR突变型肺腺癌（LUAD）细胞对奥希替尼的敏感性，其机制为LUCAT1在转录后水平与c-MET相互作用，阻止c-MET的蛋白酶体依赖性降解，进而激活下游AKT/mTOR和ERK信号通路，最终诱导耐药；同时，耐药细胞来源的外泌体可通过传递LUCAT1扩散耐药性，且血浆外泌体LUCAT1水平与患者对奥希替尼的治疗反应显著相关，可作为潜在诊断生物标志物，而靶向c-MET能有效逆转LUCAT1介导的耐药，为克服奥希替尼耐药提供了新的治疗策略和诊断靶点。