IF:12+，双肽修饰+药物负载+铁死亡，这篇脊髓损伤研究的外泌体设计，手把手教你做创新！

脊髓损伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统创伤，以神经元丢失、轴突断裂和再生能力有限为特征，常导致神经功能缺损。铁死亡在SCI后的神经细胞死亡中发挥关键作用，激活谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）以抑制铁死亡，是修复损伤脊髓的潜在策略。然而，现有治疗因难以穿透血-脊髓屏障（BSCB），疗效受限。外泌体具有生物相容性高、免疫原性低、可携带多种生物分子的天然优势，人脐带间充质干细胞（HUCMSC）来源的外泌体（MSCEXOs）在调节微环境和药物递送方面潜力显著，但针对脊髓损伤部位的靶向效率仍需提升。

今天分享的是发表在【J Nanobiotechnology】（IF：12.6）上题为“Targeted delivery of the GPX4 activator via HUCMSC-derived exosomes inhibits ferroptosis in spinal cord injury”的研究。该研究构建了多功能靶向外泌体递送系统，通过TAT肽（增强BSCB穿透性）和RVG肽（提高神经元靶向特异性）修饰MSCEXOs，并负载GPX4激活剂（GA），旨在精准抑制脊髓损伤部位的铁死亡，为SCI治疗提供新方案。

 

研究结果

1、MSC-EXOR&T-GA的表征及靶向能力评估

图1a：透射电镜（TEM）观察显示，MSC-EXOs、MSC-EXOR&T及MSC-EXOR&T-GA均呈现典型的双层膜囊泡结构。

图1b：纳米颗粒追踪分析（NTA）结果表明，三种外泌体的粒径分布具有一致性。

图1c：免疫荧光染色显示，NeuN（红色）、RVG-CP05（绿色）、TAT-CP05（橙色）与MSC-EXO（紫色）荧光信号重叠，证实TAT和RVG肽成功修饰外泌体且可进入HT22细胞。

图1d：HT22细胞中荧光强度分布曲线显示，RVG-CP05、TAT-CP05与MSC-EXO荧光信号存在多重重叠峰，进一步验证修饰成功。

图1e-f：共聚焦显微镜观察及荧光强度定量分析显示，MSC-EXOR&T处理组的相对荧光强度显著高于MSC-EXOR组，表明TAT肽增强了外泌体的细胞摄取效率。

图1g：小鼠尾静脉注射外泌体的靶向示意图，显示外泌体可到达脊髓损伤部位并穿透细胞发挥作用。

图1h：注射2小时后脊髓组织的体外荧光分析显示，损伤部位可见RVG-CP05（绿色）、TAT-CP05（红色）与DAPI（蓝色）的荧光信号，证实修饰后外泌体成功靶向SCI部位。

图1i：脊髓损伤部位的荧光强度分布曲线显示，三种信号存在重叠峰，验证外泌体表面肽修饰及在损伤部位的富集。

图1j-k：免疫荧光染色及定量分析显示，MSC-EXOR&T组在SCI部位的荧光信号显著高于MSC-EXOR组，表明TAT肽提升了外泌体的组织靶向性和穿透效率。

图1l-m：全身组织荧光分布结果显示，修饰后的外泌体在脊髓损伤部位富集更显著。

图1n：脊髓组织荧光强度定量分析证实，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组的靶向效率显著优于对照组。

这些结果表明，经TAT和RVG肽修饰的外泌体（MSC-EXOR&T）具有良好的结构稳定性，且显著提升了对神经元细胞和脊髓损伤部位的靶向性与穿透能力。

 

2、MSC-EXOR&T-GA在体外抑制RSL3诱导的铁死亡

图2a：通过RSL3处理构建HT22神经元和OLN93少突胶质细胞铁死亡模型。

图2b：细胞活力分析显示，随RSL3浓度升高，HT22细胞活力显著下降。

图2c-d：2μg/mL浓度下，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA处理均显著提高HT22细胞活力，且MSC-EXOR&T-GA的保护效果更优。

图2e-f：DCFH-DA分析检测显示，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组的ROS水平显著降低，其中MSC-EXOR&T-GA组降低最明显。

图2g：MDA水平检测显示，RSL3处理后损伤组MDA升高，而MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组显著降低，MSC-EXOR&T-GA组效果最佳。

图2h：GPX活性检测显示，MSC-EXOR&T-GA组的GPX活性显著高于其他组。

图2i：细胞内铁含量检测显示，损伤组铁含量显著升高，MSC-EXOR&T-GA处理后显著降低。

图2j-k：Western blot结果显示，RSL3处理后NCOA4表达升高，GPX4和FTH1表达降低；MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA处理可逆转该变化，且MSC-EXOR&T-GA的修复效果更显著。

图2l：随RSL3浓度升高，OLN93细胞活力显著下降。

图2m-n：MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA处理显著提高OLN93细胞活力。

图2o-p：OLN93细胞中ROS水平检测显示，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA处理显著降低ROS，其中MSC-EXOR&T-GA组效果最显著。

这些结果表明，MSC-EXOR&T-GA可通过激活GPX4、调节氧化应激和铁稳态，在体外有效保护神经元和少突胶质细胞免受RSL3诱导的铁死亡损伤。

 

3、MSC-EXOR&T-GA促进脊髓损伤后的功能恢复

图3a：SCI模型建立及治疗评估的实验时间线示意图。

图3b-c：Basso小鼠量表（BMS）评分显示，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组的后肢运动功能显著优于损伤组，且MSC-EXOR&T-GA组改善最明显。

图3d-f：CatWalk步态分析显示，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组的步序规律性指数和最大接触面积显著高于损伤组，MSC-EXOR&T-GA组步行表现最佳。

图3g：热板试验显示，MSC-EXOR&T-GA组的痛觉反应时间显著短于损伤组，表明感觉功能恢复更佳。

图3h-i：膀胱直径测量显示，MSC-EXOR&T-GA组显著减小膀胱体积，自主神经调节功能恢复更优。

图3j-k：游泳试验显示，MSC-EXOR&T-GA组的游泳评分显著高于损伤组和MSC-EXO组。

图3l-m：MRI结果显示，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组的脊髓损伤体积减小，其中MSC-EXOR&T-GA组损伤体积最小。

图3n-o：运动诱发电位（MEPs）检测显示，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组的神经元传导性显著恢复，MSC-EXOR&T-GA组的波幅更高。

这些结果表明，MSC-EXOR&T-GA治疗可显著改善脊髓损伤小鼠的运动协调能力、感觉功能和自主神经功能，减小损伤体积并保护组织完整性，促进神经传导功能恢复。

 

4、MSC-EXOR&T-GA促进神经元存活并减少星形胶质细胞活化

图4a：免疫荧光染色显示，8周时损伤组NeuN+神经元（红色）数量减少，GFAP+星形胶质细胞（绿色）活性升高；MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组神经元存活增加，星形胶质细胞活性降低，MSC-EXOR&T-GA组效果更显著。

图4b：NeuN+细胞计数定量显示，MSC-EXOR&T-GA组的神经元数量显著多于损伤组和MSC-EXO组。

图4c：GFAP荧光强度定量显示，MSC-EXOR&T-GA组的星形胶质细胞活化水平显著低于损伤组。

这些结果表明，MSC-EXOR&T-GA具有显著的神经保护作用，可促进脊髓损伤后神经元存活，抑制星形胶质细胞活化和胶质瘢痕形成。

 

5、MSC-EXOR&T-GA促进少突胶质细胞存活和髓鞘再生

图5a-b：免疫荧光染色及定量显示，损伤组Oligo2+少突胶质细胞数量显著低于假手术组；MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组显著增加，MSC-EXOR&T-GA组接近假手术组水平。

图5c-e：MBP（髓鞘碱性蛋白）和NF200免疫荧光染色及定量显示，损伤组MBP荧光强度降低，MSC-EXOR&T和MSC-EXOR&T-GA组显著升高，且MSC-EXOR&T-GA组的髓鞘再生和轴突完整性保护效果最佳。

图5f-g：Masson三色染色显示，MSC-EXOR&T-GA组的瘢痕组织减少，脊髓组织保存更完整。

图5h：LFB染色显示，MSC-EXOR&T-GA组的髓鞘保护和修复效果最显著，损伤面积减小，髓鞘完整性改善。

图5i：脊髓矢状切片中不同染色方法的检测区域示意图。

这些结果表明，MSC-EXOR&T-GA可显著促进脊髓损伤后少突胶质细胞存活，增强髓鞘再生，减少瘢痕组织形成，为神经修复提供结构支持。

 

6、MSC-EXOR&T-GA通过调控铁蛋白自噬和GPX4激活抑制铁死亡

图6a：实验设计示意图，SCI后1、3天静脉注射外泌体，7天收集组织进行转录组测序。

图6b：热图显示，与损伤组相比，MSC-EXOR&T-GA组上调铁稳态和抗氧化相关基因（如FTH1、Sqstm1），下调铁死亡促进基因（如ACSL4）。

图6c：GSEA分析显示，MSC-EXOR&T-GA组显著富集“铁离子转运”通路。

图6d：GO富集分析显示，差异基因集中在“铁离子结合”“细胞对铁离子的反应”等铁死亡调控相关术语。

图6e：KEGG富集分析显示，差异基因富集于轴突导向、TNF信号通路和铁死亡通路。

图6f：PPI网络分析显示，FTH1和NCOA4是铁死亡调控的核心枢纽基因。

图6g-h：Western blot及定量显示，MSC-EXOR&T-GA组恢复GPX4表达，降低4HNE水平，上调FTH1和NCOA4表达。

图6i-k：定量检测显示，MSC-EXOR&T-GA组的细胞内铁积累、MDA水平显著降低，GPX活性显著升高。

图6l-m：ELISA检测显示，MSC-EXOR&T-GA组的促炎因子TNF-α和IL-1β水平显著低于损伤组。

图6n：机制示意图显示，MSC-EXOR&T-GA通过调控NCOA4介导的铁蛋白降解、铁释放、脂质ROS积累及GPX4抑制，抑制铁死亡。

这些结果表明，MSC-EXOR&T-GA通过双重调控铁蛋白自噬抑制和GPX4激活，调节铁稳态、减轻脂质过氧化和炎症反应，从而抑制脊髓损伤后的铁死亡。

 

结论

本研究成功构建了经TAT和RVG肽修饰、负载GPX4激活剂（GA）的多功能靶向外泌体（MSC-EXOR&T-GA），该外泌体具有良好的结构稳定性和生物安全性，可高效穿透血-脊髓屏障并靶向富集于脊髓损伤部位；通过激活GPX4、调控铁稳态（上调FTH1和NCOA4表达）、抑制脂质过氧化和炎症反应，在体外有效保护神经元和少突胶质细胞免受铁死亡损伤，在体内显著促进脊髓损伤小鼠的神经元存活、轴突再生、髓鞘修复，减少胶质瘢痕形成，并改善运动、感觉及自主神经功能恢复；其核心机制为通过双重调控铁蛋白自噬和GPX4激活抑制铁死亡，为脊髓损伤提供了兼具靶向性、有效性和临床转化潜力的新型治疗策略，也为神经再生领域的外泌体工程化应用提供了重要参考。