IF：14+植物外泌体发文！从姜GELNs鉴定到免疫重编程，这篇RCC研究闭环绝了

肾细胞癌（RCC）是一种复发转移能力强的恶性肿瘤，现有治疗受限于耐药性和毒副作用。酪氨酸激酶抑制剂（如舒尼替尼）是临床常用药物，但存在多靶点抑制相关的血液学、肝毒性等不良反应，且耐药性不可避免。植物来源外泌体样纳米颗粒（PELNs）具有低毒、生物相容性好、易大规模制备等优势，是理想的药物递送载体。姜来源外泌体样纳米颗粒（GELNs）富含生物活性成分，但其抗RCC机制尚未明确。

今天分享的是发表在【Advanced Science】（IF：14.1）上题为“Folic Acid-Modified Ginger-Derived Exosome-Like Nanoparticles Co-Delivering Sunitinib Suppress Renal Cell Carcinoma via PI3K-Akt Pathway Inhibition, P-gp Downregulation, and Macrophage Reprogramming”的研究，该研究构建叶酸-聚乙二醇修饰的GELNs共递送舒尼替尼（FPD-GELNs/Su），通过主动-被动靶向策略，探究其通过PI3K-Akt通路抑制、P-糖蛋白（P-gp）下调及巨噬细胞重编程的多机制协同抗RCC效应，为RCC精准低毒纳米治疗提供新方案。

 

研究结果

1、GELNs的提取、表征及代谢组学分析

图1A：蔗糖梯度离心纯化流程，8/30%层为GELNs1，30/45%层为GELNs2（n=3）。

图1B：TEM显示GELNs1和GELNs2均为球形双层膜囊泡，粒径100-200nm。

图1C：NTA检测显示，GELNs1平均粒径155.9±87.1nm，GELNs2为154.5±63.3nm。

图1D：zeta电位检测显示，GELNs1为-18.1±7.79mV，GELNs2为-19.1±6.94mV。

图1E：韦恩图显示GELNs1和GELNs2存在共同代谢物。

图1F：HMDB分类显示，GELNs主要成分包括脂质及类脂质分子（39.06%）、苯类化合物（16.41%）等。

图1G：火山图显示GELNs2相对于GELNs1的差异代谢物分布。

图1H：热图显示GELNs2与GELNs1的差异代谢物表达模式。

图1I：KEGG富集分析显示，差异代谢物富集于EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等通路。

这些结果表明，通过蔗糖梯度离心可获得高纯度GELNs，其粒径、电位符合PELNs特征，且富含多种潜在生物活性代谢物，为后续功能研究奠定基础。

 

2、GELNs影响RCC进展的靶点预测及调控网络

图2A：GELNs对人RCC的药物调控网络可视化。

图2B：STRING数据库构建的GELNs相关靶点PPI网络。

图2C：Cytoscape生成的按度中心性排序的基因-基因相互网络。

图2D：ClueGO+CluePedia插件构建的基因-通路关联图，PI3K-Akt通路富集显著。

图2E：靶向人核心枢纽基因（CHGs）的化合物调控网络。

图2F：正离子模式HPLC检测显示，GELNs中6-姜烯酚、8-姜烯酚、6-姜酚均有表达。

这些结果表明，GELNs通过多成分、多靶点调控RCC进展，PI3K-Akt通路是核心调控通路，6-姜烯酚等成分可能发挥关键作用。

 

3、核心枢纽基因的分子对接分析

图3A：化合物与AKT1的分子对接结果，蓝色线为氢键，灰色虚线为疏水作用等。

图3B：化合物与PI3KCA的分子对接模式。

图3C：化合物与PI3KR1的分子对接模式。

图3D：化合物与SRC的分子对接模式。

图3E：化合物与TP53的分子对接模式。

图3F：结合能热图显示，多数化合物-受体对结合能低于-5kcal/mol，部分低于-6kcal/mol。

这些结果表明，GELNs中的生物活性化合物与RCC核心靶点具有稳定结合能力，为后续功能验证提供分子基础。

 

4、分子动力学（MD）模拟分析

图4A：五种配体-受体复合物的RMSD值波动范围窄，结构稳定。

图4B：SASA值全程稳定，结合对蛋白质表面性质影响小。

图4C：RMSF分析显示蛋白质局部残基灵活性存在差异，功能位点波动明显。

图4D：Rg分析显示蛋白质整体构象平衡，无松散或折叠现象。

图4E：氢键数量稳定在2-5个，结合特异性中等。

图4F：自由能景观显示，所有结合系统均呈现稳定单一构象。

这些结果表明，化合物与核心靶点的结合具有动力学稳定性，进一步验证了靶向作用的可靠性。

 

5、GELNs的体外抗癌效能及机制

图5A：MTT分析显示，GELNs对RenCa、786-O、OS-RC-2细胞呈剂量和时间依赖性抑制，对HK-2细胞毒性低。

图5B：克隆形成实验显示，GELNs剂量依赖性抑制RCC细胞集落形成。

图5C：EdU实验显示，8μg/mLGELNs显著抑制RCC细胞增殖。

图5D：流式细胞术显示，GELNs将RCC细胞阻滞在S期，抑制G2/M期转换。

图5E：流式细胞术显示，GELNs处理后RenCa细胞凋亡率从5.84%升至14.61%，786-O细胞从2.36%升至12.5%。

图5F：划痕实验显示，GELNs显著降低RCC细胞迁移率。

图5G：Transwell实验显示，GELNs显著减少RCC细胞侵袭数量。

图5H：Western blot显示，GELNs剂量依赖性抑制PI3K和Akt磷酸化。

图5I：体内实验显示，GELNs腹腔注射组抑瘤效果弱于瘤内注射组，口服组无显著效果。

这些结果表明，GELNs通过抑制PI3K-Akt通路，诱导RCC细胞周期阻滞、凋亡，抑制迁移侵袭，且体内给药方式影响疗效。

 

6、纳米制剂的制备与表征

图6A：¹H-NMR验证FA-PEG₂₀₀₀-DSPE（FPD）结构成功合成。

图6B：FTIR光谱显示，FPD-GELNs和FPD-GELNs/Su出现FPD特征振动峰。

图6C：TEM显示，GELNs、GELNs/Su、FPD-GELNs、FPD-GELNs/Su均为球形。

图6D：DLS检测显示，四者粒径分别为122.5±23.45nm、123.9±20.43nm、129.2±22.6nm、131.7±27.91nm。

图6E：zeta电位检测显示，四者电位分别为-20.4±5.84mV、-21.2±5.15mV、-25.2±5.43mV、-25.6±4.63mV。

图6F：HPLC显示，FPD与GELNs、GELNs/Su的结合效率分别为58.19%和58.93%。

图6G：3个月稳定性检测显示，GELNs/Su和FPD-GELNs/Su的粒径、电位无显著变化。

图6H：体外释放实验显示，pH5.6时Su释放率最高，GELNs/Su和FPD-GELNs/Su48h释放率分别为80.08±2.12%和78.25±1.62%。

这些结果表明，纳米制剂制备成功，具有均一粒径分布、良好稳定性，且在酸性肿瘤微环境中可高效释放药物。

 

7、FOLR1和FOLR2的生物信息学及RT-qPCR分析

图7A：TCGA队列分析显示，ccRCC、chRCC、pRCC中FOLR1与M0、M2巨噬细胞无显著相关性。

图7B：RT-qPCR显示，RenCa和786-O细胞的FOLR1mRNA水平显著高于HK-2细胞和巨噬细胞。

图7C：TCGA队列分析显示，FOLR2与M2巨噬细胞在各RCC亚型中呈正相关。

图7D：RT-qPCR显示，M0和M2巨噬细胞的FOLR2mRNA水平显著高于肿瘤细胞和正常组织细胞。

这些结果表明，FOLR1主要表达于RCC细胞，FOLR2主要表达于巨噬细胞，为靶向递送提供分子基础。

 

8、FPD的体内肿瘤靶向评价

图8A：活体荧光成像显示，FPD-GELNs/DiR在肿瘤部位的荧光信号持续高于GELNs/DiR。

图8B-C：主要器官荧光成像显示，FPD-GELNs/DiR在肿瘤中富集，肝脾摄取减少。

图8D-E：血清荧光检测显示，FPD修饰延长GELNs循环时间。

图8F：肿瘤冰冻切片显示，FPD-GELNs/DiR的荧光信号显著强于GELNs/DiR。

这些结果表明，FPD修饰可增强GELNs的肿瘤靶向性，减少系统清除，提升肿瘤部位富集。

 

9、FPD增强GELNs对RCC细胞的摄取及舒尼替尼敏感性

图9A：流式细胞术显示，FPD-GELNs/DiO被RenCa、786-O细胞的摄取率显著高于GELNs/DiO，24h时分别达82.85±0.65%和91.45±0.61%。

图9B：荧光显微镜显示，24h时FPD-GELNs/DiO在RCC细胞内的荧光强度更强。

图9C：MTT显示，FPD-GELNs/Su对RCC细胞的细胞毒性显著高于其他组，过量游离FPD可逆转该效应。

图9D：联合效应曲线显示，GELNs+Su呈强协同效应。

图9E-F：荧光成像及定量显示，FPD-GELNs/Su组细胞内舒尼替尼积累量最高。

图9G：负离子模式HPLC检测到GELNs中阿魏酸表达。

图9H-I：RT-qPCR和Western blot显示，FPD-GELNs显著下调ABCB1/P-gp的mRNA和蛋白水平。

这些结果表明，FPD修饰通过FA/FOLR1相互作用增强RCC细胞对GELNs的摄取，下调P-gp表达以减少药物外排，提升舒尼替尼敏感性。

 

10、FPD对巨噬细胞的靶向及极化调控

图10A：流式细胞术显示，FPD-GELNs/DiO被M0和M2巨噬细胞的摄取率显著高于GELNs/DiO，24h时分别达82.06±0.68%和99.33±0.17%。

图10B：荧光显微镜验证FPD增强GELNs对巨噬细胞的摄取。

图10C：流式细胞术显示，FPD-GELNs显著诱导M0巨噬细胞向M1（F4/80⁺CD86⁺）极化。

图10D：流式细胞术显示，FPD-GELNs显著诱导M2巨噬细胞向M1极化。

图10E-F：RT-qPCR显示，FPD-GELNs上调M1相关标志物（CD86、iNOS等），下调M2相关标志物（CD206、Arg-1等）。

这些结果表明，FPD修饰增强GELNs对巨噬细胞的靶向性，促进M1极化，重编程肿瘤免疫微环境。

 

11、巨噬细胞极化的免疫机制探究

图11A：RRA分析热图显示巨噬细胞极化相关差异基因。

图11B：SVA批量校正后的数据分布。

图11C：批量校正后的差异表达热图。

图11D：韦恩图显示RRA和批量校正共同鉴定的1686个极化特征基因。

图11E：韦恩图显示GELNs靶点与巨噬细胞极化基因的49个交集靶点。

图11F：KEGG显示，交集靶点富集于PI3K-Akt通路。

图11G：韦恩图显示GELNs中1641个共同表达的miRNA。

图11H：热图显示第10高表达miRNA。

图11I：韦恩图显示miRNA靶点与极化基因的51个交集。

图11J：KEGG显示，miRNA靶点富集于胞葬作用通路。

图11K-L：Western blot显示，FPD-GELNs显著抑制M2巨噬细胞中PI3K-Akt磷酸化，740Y-P可逆转。

图11M：RT-qPCR显示，740Y-P减弱GELNs和FPD-GELNs对CD86和CD206的调控。

这些结果表明，GELNs通过抑制PI3K-Akt通路促进巨噬细胞M1极化，FPD修饰增强该效应。

 

12、纳米制剂的体内抗癌效能及免疫重编程

图12A-C：流式细胞术显示，FPD-GELNs/Su组M1/M2比值及CD4⁺、CD8⁺T细胞浸润显著高于其他组。

图12D：免疫荧光显示，FPD-GELNs/Su组CD8⁺T细胞和IFN-γ表达最高。

图12E：体内干预时间线示意图，每3天静脉注射一次，共7次。

图12F-H：肿瘤图像、重量及生长曲线显示，FPD-GELNs/Su组抑瘤效果最显著。

图12I：IHC和TUNEL显示，FPD-GELNs/Su组Ki67阳性率最低、CD34阳性血管密度最低、凋亡细胞最多。

这些结果表明，FPD-GELNs/Su在体内显著抑制肿瘤生长，重塑免疫微环境，促进抗肿瘤免疫应答。

 

13、药代动力学及生物安全性评价

图13A：血浆药代动力学显示，FPD-GELNs/Su的AUC₀₋₂₄是游离Su的4.66倍。

图13B：肿瘤组织药代动力学显示，FPD-GELNs/Su的AUC₀₋₂₄是游离Su的5.36倍。

图13C-D：溶血实验显示，所有纳米制剂溶血率均<4%。

图13E：体重曲线显示，各治疗组小鼠无显著体重下降。

图13F：HE染色显示，主要器官无明显组织损伤。

图13G：血常规和生化指标显示，FPD修饰逆转GELNs和GELNs/Su的肝毒性，无显著肾毒性和炎症异常。

这些结果表明，FPD-GELNs/Su改善舒尼替尼药代动力学，提升肿瘤部位富集，且生物安全性良好。

 

14、纳米制剂对RCC肺转移的抑制作用

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图14A：器官荧光成像显示，FPD-GELNs/DiR在肺转移灶的富集显著高于GELNs/DiR。

图14B：肺组织切片显示，FPD-GELNs/DiR在转移灶的荧光信号更强。

图14C：肺转移模型干预时间线示意图，每3天静脉注射一次，共6次。

图14D-F：肺组织图像、转移结节计数及HE染色显示，FPD-GELNs/Su组肺转移结节最少。

这些结果表明，FPD-GELNs/Su可特异性靶向RCC肺转移灶，显著抑制转移进展。

 

结论

本研究构建的叶酸修饰姜来源外泌体样纳米颗粒共递送舒尼替尼（FPD-GELNs/Su）通过多机制协同抑制肾细胞癌：GELNs自身通过抑制PI3K-Akt通路磷酸化发挥抗癌作用；FPD修饰增强肿瘤细胞和巨噬细胞靶向性，下调ABCB1/P-gp表达以提升舒尼替尼敏感性；同时重编程肿瘤免疫微环境，促进M1巨噬细胞极化并增加T细胞浸润，显著抑制肿瘤生长和肺转移。该纳米制剂改善了舒尼替尼的药代动力学特征，降低系统毒性，为肾细胞癌的精准治疗提供了安全有效的新型策略，具有重要临床转化潜力。