外泌体新角度！不卷传统治疗，盯紧小胶质细胞重编程，研究超吸眼球！

脑出血（ICH）是一种致死率极高的神经系统疾病，核心病理机制为失控的神经炎症和继发性脑损伤，目前缺乏有效治疗手段。小胶质细胞作为大脑固有免疫细胞，在 ICH 后会快速极化为促炎表型，通过NF-κB/NOS2信号通路释放炎症因子和一氧化氮，加剧神经元凋亡与血肿周围水肿。人脐带间充质干细胞来源外泌体（hUMSC-Exos）具备跨血脑屏障递送生物活性物质、调控炎症反应的优势，在缺血性中风等模型中已展现神经保护作用，但在ICH中的作用及机制尚未完全明确。

今天分享的是发表在【J Transl Med】（IF：7.5）上题为“Human umbilical MSC-derived exosomes improve intracerebral hemorrhage recovery via SIRT1-driven suppression ofNF-KB/NOS2 signaling: coordinating microglial homeostasis and neuroprotection”的研究。该研究旨在探究hUMSC-Exos经鼻内递送对ICH小鼠的治疗效果，阐明其调控小胶质细胞稳态和神经保护的分子机制，为ICH提供新型无细胞治疗策略。

 

研究结果

1、hUMSC-Exos的表征及ICH后鼻内递送的脑摄取情况

图1A：透射电镜显示，分离的hUMSC-Exos呈典型杯状形态。

图1B：纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，hUMSC-Exos粒径分布均一，峰值直径约140-150nm。

图1C：Western blot分析hUMSC-Exos外泌体标志物Alix、CD63和TSG101的表达。

图1D：免疫荧光图像显示，PKH26标记的hUMSC-Exos在ICH小鼠血肿周围区域与DAPI共定位。

图1E：定量分析显示，鼻内递送12小时后，hUMSC-Exos在缺血半暗带呈剂量依赖性积累，20μg时达峰值。

图1F：免疫荧光显示，PKH26⁺hUMSC-Exos与血肿周围Iba1⁺小胶质细胞共定位。

图1G：免疫荧光显示，PKH26⁺hUMSC-Exos与GFAP⁺星形胶质细胞共定位。

图1H：免疫荧光显示，PKH26⁺hUMSC-Exos与NeuN⁺神经元共定位。

图1I：体外实验显示，BV2小胶质细胞在氯化血红素（Hemin）刺激下对PKH26标记hUMSC-Exos的摄取增强。

图1J：原代小胶质细胞（pMG）在Hemin刺激后，PKH26标记hUMSC-Exos与Iba1⁺细胞共定位增强。

这些结果表明，hUMSC-Exos具备典型外泌体特征，鼻内递送可高效靶向ICH小鼠血肿周围区域，且能被小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元摄取，损伤微环境可促进小胶质细胞对其摄取，为后续治疗作用奠定基础。

 

2、hUMSC-Exos促进ICH后的神经功能恢复并减少神经元凋亡

图2A：悬尾实验显示，hUMSC-Exos处理组在ICH后3-35天的运动功能显著优于ICH+PBS组。

图2B：转棒实验显示，hUMSC-Exos处理组的运动协调性和平衡能力在ICH后7-35天显著改善。

图2C：足失误实验显示，hUMSC-Exos处理组的感觉运动缺陷在ICH后7-35天明显缓解。

图2D：免疫荧光显示，ICH后35天，hUMSC-Exos处理组的髓鞘碱性蛋白（MBP）和神经丝-H（NF-H）表达显著高于ICH+PBS组。

图2E：定量分析显示，hUMSC-Exos处理组MBP荧光强度和面积显著增加。

图2F：定量分析显示，hUMSC-Exos处理组NF-H荧光强度和面积显著增加。

图2G：免疫荧光显示，ICH后3天，hUMSC-Exos处理组的Cleaved-caspase3⁺/NeuN⁺凋亡神经元数量显著少于ICH+PBS组。

图2H：免疫荧光显示，ICH后3天，hUMSC-Exos处理组的NeuN⁺神经元密度显著高于ICH+PBS组。

图2I：定量分析显示，hUMSC-Exos处理组凋亡神经元比例显著降低。

图2J：定量分析显示，hUMSC-Exos处理组神经元密度显著升高。

这些结果表明，hUMSC-Exos可改善ICH小鼠的感觉运动功能，保护髓鞘和轴突完整性，通过抑制神经元凋亡发挥急性神经保护作用，同时促进慢性期髓鞘碎片清除。

 

3、hUMSC-Exos调控小胶质细胞极化并抑制ICH后的神经炎症

图3A：免疫荧光显示，ICH后3天，hUMSC-Exos处理组Iba1⁺/CD16⁺促炎小胶质细胞数量显著少于ICH+PBS组。

图3B：免疫荧光显示，ICH后7天，hUMSC-Exos处理组Iba1⁺/CD16⁺促炎小胶质细胞数量仍显著低于ICH+PBS组。

图3C：定量分析显示，ICH后3天，hUMSC-Exos处理组促炎小胶质细胞比例显著降低。

图3D：定量分析显示，ICH后7天，hUMSC-Exos处理组抗炎小胶质细胞（Iba1⁺/Arg1⁺）比例显著升高。

图3E：qRT-PCR显示，ICH后3天，hUMSC-Exos处理组CD16、IL6、iNOS、IL1β等促炎基因mRNA水平显著下调。

图3F：qRT-PCR显示，ICH后3天，hUMSC-Exos处理组TGF-β、YM1/2、CD206、Arg1等抗炎基因mRNA水平显著上调。

图3G：免疫荧光显示，ICH后3天，hUMSC-Exos处理组Iba1⁺/CD68⁺吞噬性小胶质细胞数量显著减少。

图3H：免疫荧光显示，ICH后3天，hUMSC-Exos处理组Iba1⁺/Mac2⁺吞噬性小胶质细胞数量显著减少。

图3I：定量分析显示，hUMSC-Exos处理组CD68⁺小胶质细胞比例显著降低。

图3J：定量分析显示，hUMSC-Exos处理组Mac2⁺小胶质细胞比例显著降低。

这些结果表明，hUMSC-Exos可诱导小胶质细胞从促炎表型向抗炎表型极化，下调促炎因子表达、上调抗炎因子表达，同时抑制小胶质细胞过度吞噬活性，从而重塑ICH后的免疫微环境。

 

4、hUMSC-Exos在体外抑制Hemin诱导的小胶质细胞活化并促进抗炎表型转化

图4A：免疫荧光显示，Hemin刺激后原代小胶质细胞（pMG）中Iba1⁺/CD16⁺促炎细胞增多，hUMSC-Exos处理后显著减少。

图4B：免疫荧光显示，hUMSC-Exos处理后，原代小胶质细胞中Iba1⁺/Arg1⁺抗炎细胞显著增多。

图4C：ELISA显示，hUMSC-Exos处理显著抑制Hemin诱导的iNOS分泌。

图4D：ELISA显示，hUMSC-Exos处理显著抑制Hemin诱导的IL-1β分泌。

图4E：ELISA显示，hUMSC-Exos处理显著抑制Hemin诱导的TNF-α分泌。

图4F：ELISA显示，hUMSC-Exos处理显著上调IL-10分泌。

图4G：ELISA显示，hUMSC-Exos处理显著上调TGF-β分泌。

图4H：定量分析显示，hUMSC-Exos处理显著降低CD16⁺小胶质细胞比例、升高Arg1⁺小胶质细胞比例。

图4I：qRT-PCR显示，BV2细胞中hUMSC-Exos处理下调Il-6、Il-1βmRNA水平，上调Il-10 mRNA水平。

这些结果表明，hUMSC-Exos在体外可直接抑制Hemin诱导的小胶质细胞促炎活化，促进其向抗炎表型转化，调控炎症细胞因子分泌，验证了其细胞自主性抗炎作用。

 

5、RNA-seq分析揭示hUMSC-Exos重编程小胶质细胞的炎症转录特征

图5A：实验流程示意图，从小鼠脑组织分离小胶质细胞，提取总RNA并构建RNA-seq文库。

图5B：主成分分析（PCA）显示，Sham、ICH、ICH+Exo三组小胶质细胞转录组呈明显聚类分离，ICH+Exo组部分重叠于Sham组。

图5C：柱状图显示，ICH vs Sham组有3540个基因上调、3775个基因下调；ICH+Exo vs ICH组有783个基因上调、14%基因下调。

图5D：火山图显示，ICH vs Sham组差异表达基因（DEGs）分布，红色为上调、蓝色为下调。

图5E：热图显示，ICH vs Sham组炎症相关DEGs的层级聚类表达模式。

图5F：火山图显示，ICH+Exo vs ICH组DEGs分布，部分ICH诱导的基因变化被逆转。

图5G：热图显示，hUMSC-Exos逆转ICH诱导的炎症相关基因表达变化。

图5H：GSEA分析显示，ICH vs Sham组富集LPS应答、炎症反应、TNF产生等促炎通路。

图5I：GSEA分析显示，ICH+Exo vs ICH组富集TGF-β应答、细胞黏附、组织重塑等抗炎修复通路。

这些结果表明，hUMSC-Exos可在全基因组水平重编程小胶质细胞转录组，显著抑制ICH诱导的促炎转录程序，同时激活组织修复相关通路。

 

6、轨迹分析识别hUMSC-Exos抑制的炎症模块及iNOS⁺小胶质细胞

图6A：GO富集分析显示，ICH vs Sham组上调基因富集有丝分裂周期、细胞因子应答、固有免疫激活等通路。

图6B：GO富集分析显示，ICH+Exo vs ICH组下调基因富集细胞迁移、黏附、血管生成等病理重塑通路。

图6C：热图显示，ICH组Tnf、Trem1、Nos2、Ccr7等促炎基因显著上调。

图6D：热图显示，hUMSC-Exos处理后上述促炎基因显著下调。

图6E：时序聚类显示，Sham、ICH、ICH+Exo三组基因表达分为8个不同谱图。

图6F：谱图5基因呈“ICH后上调、Exos处理后下调”趋势，包含17个动态调控基因。

图6G：GO富集分析显示，谱图5基因富集LPS应答、中性粒细胞趋化、超氧化物代谢等炎症通路。

图6H：免疫荧光显示，ICH组Iba1⁺/iNOS⁺小胶质细胞显著增多，hUMSC-Exos处理后显著减少。

这些结果表明，hUMSC-Exos可特异性抑制ICH诱导的核心炎症基因模块，直接靶向iNOS⁺促炎小胶质细胞，阻断氧化应激相关病理过程。

 

7、SIRT1介导的NF-κB/NOS2信号抑制是hUMSC-Exos抗炎作用的核心机制

图7A：Transwell迁移实验显示，hUMSC-Exos和NOS2抑制剂1400W均显著抑制Hemin诱导的BV2细胞迁移。

图7B：qRT-PCR显示，hUMSC-Exos与1400W协同下调Nfkb1、Tnf、Cxcl1、Cxcl13等促炎基因表达。

图7C：免疫荧光显示，Hemin诱导原代小胶质细胞iNOS表达，hUMSC-Exos和1400W处理后显著减少。

图7D：定量分析显示，hUMSC-Exos与1400W联合处理对iNOS⁺小胶质细胞的抑制作用更显著。

图7E：qRT-PCR显示，SIRT1抑制剂EX527可逆转hUMSC-Exos对NOS2 mRNA的下调作用。

图7F：体内检测显示，EX527可逆转hUMSC-Exos对ICH小鼠脑组织NOS2的抑制作用。

图7G：Western blot显示，hUMSC-Exos上调ICH小鼠脑组织SIRT1蛋白水平，下调p-p65/p65比值，EX527可逆转该效应。

图7H：免疫荧光显示，hUMSC-Exos处理组Iba1⁺/SIRT1⁺小胶质细胞比例显著升高，EX527可逆转。

图7I：免疫荧光显示，hUMSC-Exos处理组Iba1⁺/NF-κBp65⁺小胶质细胞比例显著降低，EX527可逆转。

图7J：定量分析显示，hUMSC-Exos显著升高SIRT1⁺/Iba1⁺细胞比例，EX527可阻断。

图7K：定量分析显示，hUMSC-Exos显著降低NF-κB p65⁺/Iba1⁺细胞比例，EX527可阻断。

这些结果表明，hUMSC-Exos通过上调SIRT1，抑制NF-κB核转位及下游NOS2表达，形成SIRT1-NF-κB-NOS2调控轴，这是其发挥抗炎作用的核心分子机制。

 

8、SIRT1是hUMSC-Exos调控微胶质细胞增殖、神经元凋亡及行为学恢复的必需分子

图8A：免疫荧光显示，ICH组Ki67⁺/Iba1⁺增殖小胶质细胞增多，hUMSC-Exos处理后减少，EX527可逆转。

图8B：TUNEL染色显示，ICH后3天NeuN⁺/TUNEL⁺凋亡神经元增多，hUMSC-Exos处理后减少，EX527可逆转。

图8C：TUNEL染色显示，ICH后7天凋亡神经元仍增多，hUMSC-Exos的抗凋亡作用可被EX527阻断。

图8D：定量分析显示，hUMSC-Exos显著降低Ki67⁺/Iba1⁺细胞和凋亡神经元数量，EX527可完全逆转。

图8E：旷场实验显示，hUMSC-Exos处理组小鼠运动轨迹更广泛，EX527可逆转。

图8F：定量分析显示，hUMSC-Exos显著增加总运动距离和中央区域停留时间，EX527可阻断。

图8G：Morris水迷宫显示，hUMSC-Exos处理组逃避潜伏期逐渐缩短，EX527可逆转。

图8H：第34天逃避潜伏期定量显示，hUMSC-Exos组显著缩短，EX527组与ICH组无差异。

图8I：探针实验显示，hUMSC-Exos组游泳路径更集中于目标象限，EX527可逆转。

图8J：定量分析显示，hUMSC-Exos显著增加目标象限停留时间和平台穿越次数，EX527可阻断。

这些结果表明，SIRT1是hUMSC-Exos发挥微胶质细胞增殖抑制、神经元凋亡保护及感觉运动/认知功能恢复作用的必需分子，验证了SIRT1依赖的治疗机制。

 

结论

本研究证实，人脐带间充质干细胞来源外泌体（hUMSC-Exos）经鼻内递送可高效靶向脑出血（ICH）小鼠血肿周围组织，被小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元摄取；其通过上调SIRT1，抑制NF-κB核转位及下游NOS2表达，诱导小胶质细胞从促炎表型向抗炎表型转化，减少促炎因子分泌，同时抑制小胶质细胞过度增殖与吞噬，减轻神经元凋亡，保护髓鞘和轴突完整性，最终改善ICH小鼠的感觉运动和认知功能；SIRT1抑制剂EX527可完全阻断hUMSC-Exos的上述有益效应，而NOS2抑制剂可模拟其神经保护作用。这些发现揭示了hUMSC-Exos通过SIRT1-NF-κB/NOS2轴调控小胶质细胞稳态的核心机制，确立了其作为ICH无细胞治疗策略的潜力，为急性脑损伤的精准治疗提供了新的科学依据。