科研选题新思路！tLyp-1修饰外泌体介导ASO递送+ ceRNA网络，肺腺相关干预研究创新点直接学~

肺腺癌（LUAD）作为非小细胞肺癌的主要亚型，发病率和死亡率居高不下，转移是导致患者预后不佳的关键因素。环状RNA（circRNA）circRAPGEF5在LUAD中高表达，可促进肿瘤增殖和转移，是潜在治疗靶点，但如何高效、安全地将核酸药物递送至肿瘤细胞仍是临床难题。外泌体凭借低免疫原性、高生物相容性和载药能力，成为理想的核酸递送载体，而未修饰外泌体的脱靶效应限制了其应用。tLyp-1肽可特异性结合肿瘤细胞高表达的neuropilin-1（NRP1）和neuropilin-2（NRP2），实现肿瘤靶向递送。

 

今天分享的是发表在【Mater Today Bio】（IF：10.2）上题为“TLyp-1-modified exosome-mediated delivery of circRAPGEF5 ASO inhibits lung adenocarcinoma metastasis via regulating the miR-570-3p/SPP1 axis”的研究。该研究构建tLyp-1修饰的外泌体（tLyp-1-EXO），负载circRAPGEF5反义寡核苷酸（circRAPGEF5 ASO），探究其对LUAD转移的抑制作用及分子机制，为LUAD的靶向治疗提供新策略。

 

研究结果

1、tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO的构建与表征

图1A：RT-qPCR检测显示，与正常肺上皮细胞BEAS-2B相比，A549、H1299、HCC827、PC9等LUAD细胞中NRP1和NRP2表达均上调。

图1B：纳米流式检测器验证，tLyp-1肽通过链霉亲和素-生物素系统成功连接至外泌体表面，HA标签检测呈阳性。

图1C：Cy3标记的circRAPGEF5 ASO成功负载至tLyp-1修饰外泌体中，可观察到红色荧光信号。

图1D：多功能酶标仪检测显示，circRAPGEF5 ASO的负载效率约为60%。

图1E：TEM观察显示，EXO、tLyp-1-EXO、tLyp-1-EXO-NC、tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO均呈典型双层盘状形态。

图1F：纳米流式分析显示，修饰前后外泌体粒径分布在52-160nm之间，平均粒径为52-134.5nm。

图1G：Western blot验证，四种外泌体均表达CD63、CD9、TSG101等外泌体标志物，几乎不表达内质网标志物calnexin。

图1H：动态光散射（DLS）检测显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO在PBS中连续7天粒径稳定在181-189.1nm，zeta电位从-15.1mV轻微降至-17.9mV。

图1I：药物释放曲线显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO在PBS中2小时释放率为11%，24小时释放率达95%。

这些结果表明，tLyp-1修饰和circRAPGEF5 ASO负载未改变外泌体的基本形态和标志物表达，构建的tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO具有良好的稳定性和药物缓释能力，符合核酸递送载体的要求。

 

2、tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO的体内外靶向性与载体递送

图2A：共聚焦荧光成像显示，DiO标记的tLyp-1-EXO与A549细胞共培养4小时和12小时后，绿色荧光强度显著高于未修饰EXO组。

图2B：共聚焦荧光成像显示，tLyp-1-EXO与HCC827细胞共培养后，细胞内荧光强度明显高于EXO组。

图2C：共聚焦荧光成像显示，Cy3标记的circRAPGEF5 ASO可通过tLyp-1-EXO成功递送至细胞内，红色荧光与细胞核蓝色荧光共定位。

图2D：RT-qPCR检测显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理组A549和HCC827细胞中circRAPGEF5表达水平显著低于PBS、EXO和tLyp-1-EXO-NC组。

图2E：IVIS成像显示，尾静脉注射DiR标记的tLyp-1-EXO后，4小时和24小时肿瘤部位荧光强度显著高于未修饰EXO组。

图2F：荧光强度定量显示，tLyp-1-EXO在肿瘤部位的富集量显著高于EXO组，且24小时仍保持较高荧光信号。

这些结果表明，tLyp-1修饰可显著增强外泌体对LUAD细胞的体外靶向结合与内化能力，实现circRAPGEF5 ASO的高效递送并下调靶基因表达，同时在体内具有良好的肿瘤靶向性和滞留能力。

 

3、tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO的体外抗肿瘤效应

图3A：CCK-8实验显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后，A549细胞增殖活性显著低于PBS、EXO和tLyp-1-EXO-NC组。

图3B：CCK-8实验显示，HCC827细胞增殖活性在tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后显著降低。

图3C：克隆形成实验显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO组A549细胞形成的克隆数显著少于其他三组。

图3D：克隆形成实验显示，HCC827细胞克隆形成能力在tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后显著下降。

图3E：Transwell实验显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO显著减少A549细胞的迁移和侵袭数量。

图3F：Transwell实验显示，HCC827细胞的迁移和侵袭能力在tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后显著受抑。

图3G：Western blot显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后，A549细胞中EMT标志物N-cadherin和vimentin表达显著下调。

图3H：Western blot显示，HCC827细胞中N-cadherin和vimentin蛋白水平在tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后显著降低。

这些结果表明，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO在体外可显著抑制LUAD细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，并下调EMT相关标志物表达，发挥抗肿瘤效应。

 

4、circRAPGEF5作为miR-570-3p海绵促进LUAD进展

图4A：Circular RNA Interactome预测显示，circRAPGEF5与miR-570-3p存在潜在结合位点。

图4B：双荧光素酶报告实验显示，共转染circRAPGEF5 WT和miR-570-3p mimic后，A549细胞的荧光素酶活性显著降低，突变体组无明显变化。

图4C：RT-qPCR检测显示，miR-570-3p在LUAD细胞中的表达水平显著低于正常BEAS-2B细胞。

图4D：RT-qPCR显示，circRAPGEF5过表达后，LUAD细胞中miR-570-3p表达显著下调。

图4E：RT-qPCR显示，circRAPGEF5敲低后，LUAD细胞中miR-570-3p表达显著升高。

图4F：CCK-8实验显示，转染miR-570-3p inhibitor后，A549细胞增殖活性显著增强。

图4G：CCK-8实验显示，转染miR-570-3p mimic后，H1299细胞增殖活性显著降低。

图4H：克隆形成实验显示，miR-570-3p inhibitor处理后，A549细胞克隆形成能力增强。

图4I：克隆形成实验显示，miR-570-3p mimic处理后，H1299细胞克隆数显著减少。

图4J：Transwell实验显示，miR-570-3p inhibitor促进A549细胞迁移和侵袭。

图4K：Transwell实验显示，miR-570-3p mimic抑制H1299细胞迁移和侵袭。

这些结果表明，circRAPGEF5可作为miR-570-3p的分子海绵，下调其表达，而miR-570-3p本身具有抑制LUAD细胞增殖、迁移和侵袭的功能，circRAPGEF5通过吸附miR-570-3p促进肿瘤进展。

 

5、miR-570-3p逆转circRAPGEF5的促肿瘤效应

图5A：CCK-8实验显示，共转染OE-circRAPGEF5和miR-570-3p mimic后，HCC827细胞增殖活性显著低于OE-circRAPGEF5+ mimic NC组。

图5B：CCK-8实验显示，miR-570-3p mimic可逆转OE-circRAPGEF5对H1299细胞的促增殖作用。

图5C：克隆形成实验显示，miR-570-3p mimic显著抑制OE-circRAPGEF5诱导的HCC827和H1299细胞克隆形成。

图5D：Transwell实验显示，miR-570-3p mimic可逆转OE-circRAPGEF5促进HCC827和H1299细胞迁移和侵袭的效应。

图5E：CCK-8实验显示，共转染KD-circRAPGEF5和miR-570-3p inhibitor后，A549细胞增殖活性高于KD-circRAPGEF5+inhibitor NC组。

图5F：CCK-8实验显示，miR-570-3p inhibitor可逆转KD-circRAPGEF5对H1299细胞增殖的抑制作用。

图5G：克隆形成实验显示，miR-570-3p inhibitor恢复了KD-circRAPGEF5处理后A549和H1299细胞的克隆形成能力。

图5H：Transwell实验显示，miR-570-3p inhibitor逆转了KD-circRAPGEF5对A549和H1299细胞迁移和侵袭的抑制作用。

这些结果表明，miR-570-3p是circRAPGEF5促LUAD进展的关键下游分子，可直接逆转circRAPGEF5的肿瘤促进效应，进一步验证了二者的相互作用。

 

6、miR-570-3p直接调控SPP1表达，circRAPGEF5通过miR-570-3p/SPP1轴促进LUAD进展

图6A：双荧光素酶报告实验显示，共转染miR-570-3p mimic和SPP1 3'UTR WT后，LUAD细胞荧光素酶活性显著降低，突变体组无明显变化。

图6B：RT-qPCR显示，miR-570-3p mimic处理后SPP1表达显著下调，miR-570-3p inhibitor处理后SPP1表达显著上调。

图6C：CCK-8实验显示，SPP1过表达后，A549和HCC827细胞增殖活性显著增强。

图6D：克隆形成实验显示，SPP1过表达促进A549和HCC827细胞克隆形成。

图6E：Transwell实验显示，SPP1过表达显著增强A549和HCC827细胞的迁移和侵袭能力。

图6F：RT-qPCR显示，circRAPGEF5过表达后SPP1表达上调，circRAPGEF5敲低后SPP1表达下调。

图6G：CCK-8实验显示，共转染KD-circRAPGEF5和pcDNA-SPP1后，A549和HCC827细胞增殖活性高于KD-circRAPGEF5+pcDNA-NC组。

图6H：克隆形成实验显示，SPP1过表达可逆转KD-circRAPGEF5对A549和HCC827细胞克隆形成的抑制作用。

图6I：Transwell实验显示，SPP1过表达恢复了KD-circRAPGEF5处理后A549和HCC827细胞的迁移和侵袭能力。

这些结果表明，SPP1是miR-570-3p的直接靶基因，circRAPGEF5通过吸附miR-570-3p解除其对SPP1的抑制，进而促进LUAD细胞增殖、迁移和侵袭，即circRAPGEF5/miR-570-3p/SPP1轴调控LUAD进展。

 

7、tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO调控miR-570-3p/SPP1轴

图7A：RT-qPCR显示，共转染OE-circRAPGEF5和miR-570-3p mimic后，HCC827细胞中SPP1表达显著低于OE-circRAPGEF5+mimic NC组。

图7B：RT-qPCR显示，共转染KD-circRAPGEF5和miR-570-3p inhibitor后，A549细胞中SPP1表达高于KD-circRAPGEF5+inhibitor NC组。

图7C：Western blot显示，miR-570-3p mimic可下调OE-circRAPGEF5诱导的HCC827细胞SPP1蛋白表达。

图7D：Western blot显示，miR-570-3p inhibitor可上调KD-circRAPGEF5抑制的A549细胞SPP1蛋白表达。

图7E：RT-qPCR显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后，A549和HCC827细胞中miR-570-3p表达显著上调。

图7F：RT-qPCR显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后，A549和HCC827细胞中SPP1表达显著下调。

这些结果表明，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO可通过敲低circRAPGEF5，解除其对miR-570-3p的吸附，进而下调SPP1表达，调控miR-570-3p/SPP1轴发挥作用。

 

8、tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO的体内抗肿瘤转移效应及生物安全性

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图8A：体内转移模型构建与治疗流程：尾静脉注射A549-LUC细胞1周后，每4天尾静脉注射tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO、tLyp-1-EXO-NC或PBS，共6次，期间监测肿瘤生长。

图8B：IVIS成像显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO组裸鼠肺部荧光信号显著弱于PBS和tLyp-1-EXO-NC组，表明肿瘤转移受到抑制。

图8C：裸鼠肺部组织观察显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO组肺转移结节数量显著少于其他两组。

图8D：HE染色显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO组肺部肿瘤组织浸润范围显著小于PBS和tLyp-1-EXO-NC组。

图8E：CCK-8实验显示，不同浓度（1、5、20、50、100μg/mL）的tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO与BEAS-2B细胞共培养24小时后，细胞活力无显著变化。

图8F：裸鼠体重监测显示，治疗期间各组裸鼠体重无明显差异，未出现体重下降。

图8G：HE染色显示，各组裸鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏组织无明显结构损伤。

图8H：血清生化检测显示，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO组裸鼠ALT、AST、UREA、CRE水平与PBS组无显著差异，无明显肝肾功能毒性。

这些结果表明，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO在体内可显著抑制LUAD转移，且对正常细胞和裸鼠主要脏器无明显毒性，生物安全性良好。

 

结论

本研究成功构建了tLyp-1修饰的外泌体递送系统tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO，该系统通过tLyp-1肽与LUAD细胞高表达的NRP1/2结合，实现肿瘤靶向递送，高效敲低circRAPGEF5表达；分子机制上，circRAPGEF5作为miR-570-3p的分子海绵，其敲低可释放miR-570-3p，进而抑制靶基因SPP1表达，通过circRAPGEF5/miR-570-3p/SPP1轴抑制LUAD细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化；体内实验证实该递送系统可显著抑制LUAD转移，且无明显生物毒性。该研究为LUAD的靶向治疗提供了新型高效的核酸递送载体和潜在治疗靶点，具有重要临床转化价值。